纳米炭示踪胃癌前哨淋巴结的实验研究.docx
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纳米炭示踪胃癌前哨淋巴结的实验研究
纳米炭示踪胃癌前哨淋巴结的实验研究
（作者：
单位：
邮编：
）
作者：
陈卫东，汤文浩，柏志斌
【摘要】目的：
通过纳米炭示踪兔胃癌前哨淋巴结的对照研究，
为纳米炭应用于胃癌的临床研究打下基础。
方法：
兔胃癌病灶周围浆
膜下分别注射99Tcm）：
SC和纳米炭混悬液（卡纳琳），记录两种示踪法检测到前哨淋巴结（SLN的例数、SLN数目及分布情况，计算两种示踪法检测SLN的敏感性、特异性、假阴性率和预测区域淋巴结转移的准确性以及SLN和非前哨淋巴结（NSLN的转移率。
结果：
纳米炭与99Tcm）；SCSLN的检出率及数目，显示SLN分布情况、SLN的转移率差异均无统计学意义（P>0.05）。
两种示踪法检测SLN的敏感性、特异性、假阴性率、准确性差异均无统计学意义（P>0.05）。
结论：
纳米炭示踪胃癌前哨淋巴结效果与放射性核素99Tcm'SC是一致的，但纳米碳示踪法具有显影快而持久、无放射性、使用方便等优点，可替代放射性核素用于胃癌的临床研究。
【关键词】胃癌；前哨淋巴结；纳米炭
[Abstract]Objective:
Toevaluatetheclinical
applicationofnano扌以carboninvisualizationofsentinellymph
node（SLN）ingastriccancersurgery.Methods:
RabbitgastriccancermodelwasestablishedbytransplantationofVX2cellsintothegastricserosa.Nano#）：
carbonand99Tcm）；SCwere
injectedrespectivelyintothegastricwallinrabbitmodelofgastriccancer.Thecases,thenumbersandthedistributionofSLNweredocumented.Thenthesensibility,specificity,falsenegativerateandtheaccuraterateoflocallymphnode
metastasiswerecalculated,themetastasisratioofSLN,NSLNwereevaluated.Results:
Asfarastheisolatingrate,the
numbers,thedistributionandthemetastasisrateofSLNwasconcerned,nosignificantdiffereneewasshownbetweenthetwo
groups（P>0.05）.Moreover,thesensibility,specificity,falsenegativerateandtheaccuraterateoflocallymphnode
metastasiswerenotdiffereneebetweentwogroups（P>0.05）.Conclusions:
Nano扌以carbonhasasimilareffectwith99Tcm〔SCinSLNvisualization.Furthermore,itcanbeusedingastriccancersurgerytoreplaceradionuclide,consideringits
quick拟detection,nonMradioactivityandconvenience.
[Keywords]gastriccancer;sentinellymphnode;
nano拟carbon前哨淋巴结（sentinellymphnodes,SLN是指最先接受
肿瘤引流的第一组区域淋巴结。
前哨淋巴结的概念首先应用于阴茎癌患者区域淋巴结状况的评估［1］,此后，前哨淋巴结活检（SLNB）在临床上相继应用于乳腺癌、甲状腺癌、外阴癌、头颈部肿瘤等实体肿瘤，以指导手术方案的制定。
国内外的学者也基本达成共识：
如果SLN无肿瘤细胞转移，那么其他区域性淋巴结发生肿瘤转移的可能性极小，不必进一步扩大手术范围；如果前哨淋巴结有转移，则其他淋巴结转移的危险性很大，需要扩大手术范围［2拟3］。
然而，前哨淋巴结活检技术应用于胃癌的临床还有争议［4］。
本研究通过纳米炭示踪兔胃癌前哨淋巴结的对照研究，为纳米炭应用于胃癌的临床研究打下基础。
1材料与方法
1.1材料、试剂及仪器
VX2细胞株（东南大学放射与介入中心提供）；日本大耳兔36只，雌雄各18只（东南大学医学院动物实验中心提供，3〜4月龄，体重2.0〜2.5kg）;纳米炭混悬液（重庆莱美药业产品，平均粒径129nm）;放射性核素99Tcm）：
SC（南京森科医药技术有限公司产品）；丫计数器探测仪NAVIGATORGPS美国外科公司产品）；显微摄像系统（日本Nikon公司产品）；普通显微镜（Olympus公司产品）；腹部手
术器械（东南大学医学院动物外科提供）
1.2实验方法
1.2.1VX2传代兔的制备
将-196C液氮保存的VX2肿瘤细胞株按一般细胞培养技术进行复苏后，将肿瘤细胞悬液调整成106mm-3活细胞浓度。
取该悬液0.5ml接种于4只种兔后腿外侧的肌肉内，2周后可触及肿块即制成了荷瘤兔。
取荷瘤兔后腿生长活跃的肿瘤组织，剔除筋膜和坏死组织，取边缘生长旺盛的鱼肉样组织，剪成1~2mm3大小组织块用于种植。
1.2.2兔VX2胃癌模型的制作
剩余32只大耳兔称重，静脉麻醉后，取仰卧位固定，上腹部局部剃毛，碘伏消毒。
取上腹正中切口进腹（切口长2〜3cm），找到
胃窦部，切开胃窦前壁浆肌层，将肿瘤组织块2枚装载于硬膜外穿刺针内，通过硬膜外穿刺针将肿瘤组织埋植于黏膜下，结扎预置的浆肌
层缝线，关闭胃壁伤口，关腹。
麻醉清醒后送动物中心喂养。
1.2.3胃癌前哨淋巴结两种示踪方法的对照研究
动物喂养3周后再次剖腹，统计建模成功率。
于荷瘤兔胃肿瘤病灶周围1.0cm处选择四点，每点浆膜下分别注射99Tcm：
SC0.1ml
（0.2卩Ci）和纳米炭0.1ml（5mg）。
纳米炭注射试剂后1~5min就会显示出2〜4条染色的细小淋巴管，沿着显影的淋巴管就会发现黑染的淋巴结，最早被染色的淋巴结判定为纳米炭组前哨淋巴结
（SLN，观察并记录被纳米炭黑染的前哨淋巴结数目和分布情况。
99TcmU.SC注射后每隔10min分别用丫闪烁计数器（NAVIGATORPS
检测99Tcm示踪的前哨淋巴结的数目和分布情况，直至120min结束；丫闪烁计数器探测放射线水平高于背景10倍以上的淋巴结判定为核素组SLN记录其数目及分布情况。
分别切取纳米炭和99Tc1.2.4病理学检查
两种方法示踪的SLN胃肿瘤病灶及NSLN（非前哨淋巴结）等标本经10沟醛溶液固定后，制作石蜡切片，HE染色，观察胃肿瘤病理特征、SLN的转移及NSLN的转移。
1.3统计学处理
实验数据以x-士s或百分率表示，组间计量资料比较采用t检验；计数资料比较进行卡方检验（或Fisher'sexact检验）。
应用SPSS13.0forWindows统计软件完成，P0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1建模成功率
32只实验动物于胃窦前壁种植VX2肿瘤组织块，3周后有
27只在胃窦部发现肿瘤并经病理证实为恶性肿瘤组织，建模成功率
为84.4%（27/32）;肿瘤直径为0.5〜2.4cm平均（1.33士0.39）cm胃肿瘤分期：
IB期10例，H期9例，皿A期3例，皿B期2例,W期3例。
2.2两种示踪法检测SLN的比较
见表1。
表1两种示踪法检测SLN比较（略）
2.3两种示踪法检测SLN的正确性比较
见表2。
表2两种示踪法检测SLN的正确性比较（略）
2.4纳米炭示踪的SLN黑染的程度及淋巴管显影情况见图1、2。
2.5两种示踪法的检测SLN所需时间
纳米炭法检测SLN所需时间为（4.06士2.12）min;核素法（28.17士13.48）min，两者差异有统计学意义（P0.01）。
其中纳米炭示踪的SLN在实验观察的120min内无明显褪色。
2.6SLN与非前哨淋巴结（NSLN转移率比较
两种示踪法共检测SLN共41枚，其中转移SLN18枚，转移率为43.9%;27只兔共切取NSLN244枚，其中转移淋巴结39枚,转移率16.0%，两者比较差异有统计学意义（P0.01）。
3讨论
在我国胃癌发病率居消化道恶性肿瘤的首位，并有上升趋
势。
手术是目前惟一有可能治愈胃癌的方法。
胃癌的预后直接与肿瘤
浸润程度、淋巴结转移或肝和腹膜转移等因素相关［5］。
在日本，根据消化道肿瘤的外科和病理学研究，以上因素已作为肿瘤分期的标准；其中淋巴结转移在生存率的多因素分析中是一重要的影响因素
:
6拟7］。
术中是否彻底清除了转移淋巴结是影响手术疗效的关键，临床上常见有两种倾向：
（1）大范围的淋巴结清扫，切除很多没有转移的无辜淋巴结及其组织，造成并发症增多；
（2）切除范围不够，造成转移淋巴结残留，导致日后很快复发。
如何根据每个个体确定科学合理的淋巴结清扫范围，这是外科医师共同关注的问题，也是胃癌外科的难点所在。
前哨淋巴结的概念为其提供了理论依据。
目前，前哨淋巴结有两种常用的检测方法：
一种放射性核素法，即使用放射性核素标记物作为示踪剂，术中丫计数器探测仪检测手术区域，探测放射线水平高于背景10倍以上的淋巴结作为前哨淋巴结，术后丫计数器探测仪检测术后标本。
此法简单，放射性核素在前哨淋巴结内停留时间较长，并且可记录，显像灵敏度较高。
但
Masahiro等］8］则认为，由于受到原发病灶放出的丫射线的影响，放射性核素示踪很难明确检测出前哨淋巴结；另外患者和医护人员要
接触放射性物质；放射性物质来源困难，使用受限制。
另一种是染色剂染色显影法，常用的染色剂有亚甲蓝、专利蓝、isosulfanblue
等染料。
染色显影法简单，可以清晰显示淋巴管和淋巴结，具有实时观察的优点，且医患无须接触放射性同位素，不需要特殊的设备和仪器，显像时间短而且直观，可以指导术中手术操作，医疗成本低。
但染色显影法存在染色需较长的时间且着色不充分、染色剂淋巴结内滞
留时间短、淋巴特异性差、术中使用会造成淋巴管、组织间隙广泛染色等缺点，而且有1.5%的患者对染色剂过敏。
纳米炭混悬注射液为淋巴示踪剂，具有吸附性能优良、淋巴靶向性极高、组织内滞留性和示踪速度良好、不进入血液循环等特点，其团粒粒径平均为129nm。
注射到肿瘤局部组织后，可被巨噬细胞吞噬。
同时，由于毛细血管内皮细胞间隙为20〜50nm而毛细淋巴管内皮细胞间隙为120〜500nm且基膜发育不完全，故纳米炭粒不进人血管，迅速进人淋巴管，滞留集聚到淋巴结，数分钟内能使引流淋巴结明显而持久地染色，便于术中辨认，减少组织损伤，增加清除淋巴结的数目，减少肿瘤复发的几率。
在这些被黑染的淋巴结中，有些淋巴结虽然直径在0.2〜0.3cm，但已有转移，这些微小的淋巴结在常规根治术中易被忽略，而采用本方法很容易找到而被清除。
本实验中纳米炭与放射性核素99Tcm：
SC在胃癌SLN的检出数目、检出率、
分布规律、敏感性、特异性、假阴性率和预测区域淋巴结转移的准确性等方面无明显差异；纳米炭淋巴结平均显影时间为（4.06士2.12）
min，显影时间明显较99Tcm以SC缩短，且淋巴结染色满意，完全黑染率为77.8%;操作较简单，医患无须接触放射性核素，不需要特殊的设备和仪器，显像直观，能够替代放射性核素用于胃癌前哨淋巴结的检测，更适合于手术中使用。
胃周淋巴结根据JRSGC规则主要分为3站18组，这些不同分组的淋巴结虽分别代表胃不同区域的淋巴回流，但其互相成网状沟
通。
一般情况下，胃淋巴由第1站向第2、3站引流，但胃癌的淋巴引流是复杂的，SLN有随机性、多向性和跳跃性的特点。
Sano等］9］的研究表明，首先转移的淋巴结仅62%在病灶周围，“跳跃转移”的几率高达13%，且淋巴回流径路可因人和病灶而异，使得应用示踪剂定位的胃癌SLN分布难以预测。
本实验27只实验兔中SLN仅位于N1的占65.2%，仅位于N2的占13.6%，与上述结果相仿，也存在“跳跃转移”。
而SLN的定义是首先接受肿瘤淋巴液，最早转移的淋巴结，均可认为是SLN淋巴结转移的“跳跃性”只是相对于解剖位置而言。
因此，我们理解，与其说SLN是一形态、解剖学概念，不如说是功能、外科学概念。
当首先转移的淋巴结出现在N2或N3时，功
能上其实相当于N1。
如果SLN检测能发现胃癌异常解剖部位的“跳跃性”转移淋巴结，将对指导胃癌手术切除范围、提高胃癌分期准确性有重要意义。
Gervasoni等］10］研究发现，如果区域淋巴结转移
的机会5%，不做广泛的淋巴结清扫是可以接受的，胃癌的
SLNB允
许有5%的假阴性率。
本实验SLN转移率明显高于NSLN转移率，说明胃癌淋巴结转移最易发生在SLN因此，本研究也证实了SLN概念同样适用于胃癌，可在术中通过示踪剂准确识别，并能准确反映胃癌周围淋巴结的转移情况。
根据纳米炭对淋巴结的咼亲和性和炭的吸附性能，
近来有学
者将其吸附化疗药物后，作为淋巴靶向化疗，功能性缓释给药。
这能提高淋巴结内化疗药物的浓度，更好地发挥对癌细胞的杀灭作用，克服化疗药物全身使用所致的严重毒副反应；术前及术中使用可防止医源性肿瘤扩散，对失去手术机会的晚期或复发癌肿可作定向化疗，改
善症状，提高生活质量，延长生命。
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