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霍乱弧菌的分离与鉴定

濮阳市疾病预防控制中心

一、标本的采集和送检:

1.标本的采集：

1）粪便标本：

应争取在发病早期、服用抗菌药物之前采集；

2）采便方法：

可用棉拭采取自然排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭采便管由肛门插入直肠内3～5厘米处采取。

3）采样要求：

☞水样便采取1～2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。

病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可作为检材。

☞外环境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等。

☞按1:

10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。

4）肛拭采集的注意事项：

1.棉拭子要用竹签，圆形、光滑以免采样时易断；

2.棉拭子做的要稍大而紧固（避免采集时脱落）；

3.采集者应穿戴一次性手套；

4.采集前将棉拭子用碱性蛋白胨水（APW）蘸湿，多余的液体紧靠管壁挤出；

5.采集时要求被采集者双腿分立、微屈、手扶墙或凳子趴下，劝其用单手或双手协助分开股沟（或采集者用左手分开股沟），右手持棉拭子轻轻旋转插入肛门内约4～5cm（幼儿约2～3cm）处，转动数秒钟从紧靠肛环边的隐窝旋转擦取直肠表面黏液后退出；

6.棉拭子在推进时如感觉遇到阻力，应调整角度后缓缓旋转推进，避免用力过大或推进太快造成肛壁出血而影响病原菌的检出；棉拭子进入的深度一定要够，否则采集的有效标本量会很少；

7.采集的标本拭子应立即置入APW内，手接触的部分在管口折断弃去。

填写采样登记表（单），并在采样管上填写被采集者的样品编号、姓名、性别、年龄，尽快送检。

二、快速诊断：

1.直接镜检：

为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。

2.特异性制动试验：

☞取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加霍乱弧菌O1多价或O139诊断血清，加盖玻片，用暗视野显微镜观察，3分钟内流行状运动细菌被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异，操作简便，可

☞在几分钟之内做出初步诊断。

但要求标本必须有较多数量的弧菌，免疫血清最好是不加防腐剂的。

3.早期玻片凝集试验：

☞埃尔托弧菌在TCBS、4号琼脂及庆大霉素平皿上生长较快，37℃培养8～10小时，在其他杂菌尚未生长或长出很小菌落的情况下，埃尔托型菌落直径可达1～2mm。

将已长出较大半透明菌落或湿润菌苔的平皿取出，直接用霍乱多价血清做玻片凝集，阳性者可做初步报告。

琼脂平皿继续培养，接常规培养时间再作一次复查。

4.霍乱弧菌胶体金免疫层析快速检测：

（1）原理：

采用胶体金免疫层析双抗体夹心法，检测标本中霍乱弧菌。

以胶体金作为标记物，交联抗霍乱弧菌（O1群/O139群或O1群E1Tor型小川血清型、稻叶血清型）单克隆抗体，与样品中的霍乱弧菌（O1群/O139群）结合。

形成双抗体夹心一步法，呈现出目测可见的红色条带，显色程度与抗原含量成正比。

（2）特点：

☞灵敏度高、特异性强，操作简便、快速，省力省时；

☞对于典型霍乱病人水样或米泔样便结果准确、易于判读；

☞但对于含霍乱弧菌少的粪便标本易出现假阴性；

☞对脓血便标本易出现假阳性。

3）操作步骤：

☞将检测卡放置与洁净、干燥的工作台上；

☞实验前，请将试剂恢复至室温；

☞用吸管取病人水样便样品2～3滴，加入检测

卡一端的加样孔，计时并观察反应结果；

☞2-15分钟内观察结果，20分钟之后结果不能

判读。

（1）滤样纸（加样区）；

（2）玻璃纤维膜，膜上吸附着干燥的金标抗原；

（3）硝酸纤维素膜，膜上包被的抗原和抗体呈线状；

（4）吸水纸。

三、直接分离、培养：

☞急性期病人水样大便标本在增菌培养的同时可用选择性培养基直接划线分离。

目前常用的强选择性培养基有TCBS琼脂、4号琼脂和庆大霉素琼

脂等。

☞置37℃10～14h孵育培养。

四、APW增菌、分离：

☞所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人，带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出，需经碱胨水37℃增菌6～8小时后分离（夏日可将运送时间计算在内）；

☞标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1～0.2毫升，接种于8～10毫升的碱胨水中，37℃培养6～8小时后再做分离；

☞霍乱弧菌好氧，易形成的菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10～14h孵育培养。

五、血清学凝集试验：

1.玻片凝集试验：

☞自分离培养基上挑取可疑菌落与O1群霍乱多价诊断血清、O139群霍乱诊断血清以及稻叶、小川型诊断血清做玻片凝集试验；

☞同时注意做盐水凝集对照试验。

2.要求及注意事项:

☞有的标本可能同时存在非O1群霍乱弧菌，可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查;

☞必要时，取原划线菌苔边缘透明部分再做玻片凝集（对一次流行的首批病人进行检验时尤应注意）。

☞平皿分离未获分散的单个菌落，而在密集部位仍有可疑菌落时，应将该部分再做分离或经增菌后再做分离;

☞从恢复期病人分离出菌落典型但不凝集的弧菌，这时应以霍乱粗糙型血清做玻片凝集，以确定是否为粗糙型或NAG弧菌；

☞注意当霍乱弧菌在4号及庆大霉素培养基上生长过久（超过36小时）时，会出现菌落粘稠、血清凝集假阴性现象；

☞故应取新鲜培养物（10～14h）作凝集试验，凝集的菌落立即转种营养琼脂平板。

☞小川型菌株有时在稻叶型单价血清中可出现弱凝集，这并非彦岛型，而是小川型含有少量C抗原成分的缘故；

☞首例病人应以两个单价血清的试管凝集试验确定。

六、初步鉴定试验：

1.氧化酶试验：

在非选择性或非鉴别性培养基如营养琼脂的新鲜培养物上滴加氧化酶试剂1滴，并使其流开。

或将菌落用竹签或牙签挑至滴有试剂的滤纸上，在1分钟内出现粉红－紫红－紫蓝色（有的最后呈黑紫色）为氧化酶阳性。

（肠杆菌科细菌多不变色或变成粉红色后很快退色为氧化酶阴性）。

氧化酶试验注意事项：

试验时避开含铁物质（如接种环）。

不能直接取产酸培养基上的菌落，不能取含还原剂的培基及含亚碲酸盐培基上的菌落（亚碲酸盐培养基可抑制氧化酶），以免出现假阳性和假阴性。

2.拉丝试验：

在玻片上加一滴试剂，取一接种环被检菌的新鲜琼脂培养物在试剂旁边研磨均匀，再与试剂混合制成浓厚悬液。

阳性者很快（30S内）由混变清并变得很粘稠，用接种环挑取时，可以拉出细丝来。

阴性者呈均匀悬液状态，与蒸馏水对照相同。

（古典型、埃尔托型和O139群霍乱弧菌均阳性。

）

弧菌科菌属氧化酶试验、拉丝试验鉴别表

弧菌科

氧化酶试验

拉丝试验

弧菌属

（目前发现具

致病性弧菌）

O1群霍乱弧菌

＋

O139霍乱弧菌

＋

NAG弧菌

＋

河弧菌

＋

霍利斯弧菌

＋

少女鱼弧菌

＋

＋（80%）

弗尼斯弧菌

＋

副溶血弧菌

＋

＋（64%）

溶藻弧菌

＋

＋（91%）

拟态弧菌

＋

麦氏弧菌

－

＋

创伤弧菌

＋

辛辛那提弧菌

＋

气单胞菌属

气单胞菌

＋

－（90%）

邻单胞菌属

类志贺邻单胞菌

＋

－

3.O/129（二氨基二异丙基喋啶）敏感试验：

☞用接种环或灭菌棉拭子在含0.5％氯化钠的普通平皿上均匀涂抹待检菌，放上10µg、150µgO/129磷酸盐药敏纸片各一片，37℃培养过夜。

凡药敏纸片周围出现抑菌圈者为敏感。

☞古典型、埃尔托型霍乱弧菌二者均敏感；

☞O139群霍乱弧菌10µg、150µg均不敏感。

七、初步结果报告：

B霍乱弧菌以血清学鉴定为主，结合菌落形态、特征和初步生化反应可做出

判定。

凡具备弧菌菌落特征、与O1群或O139群多价血清凝集，O1群并可用单价血清分型即可判定。

首例病人应辅以氧化酶、拉丝试验、O/129敏感试验。

基层CDC至此即可上报。

8上报国家需做生化、噬菌体-生物分型试验。

+报告名称－－“稻叶/小川型O1群埃尔托型霍乱弧菌”或“O139群埃尔托型霍乱弧菌”。

八、生化鉴定试验：

试验项目

O1群

O139群

NAG

试验项目

O1群

O139群

NAG

氧化酶

甘露糖

+/-

粘丝

阿拉伯糖

O/129敏感（10µg）

肌醇

O/129敏感（150µg）

赖氨酸脱羧酶

动力

鸟氨酸脱羧酶

靛基质

精氨酸双解酶

V-P

+/-

0％盐胨水

甲基红

-/+

3％盐胨水

硝酸盐还原

6％盐胨水

+/-

葡萄糖产酸

8％盐胨水

葡萄糖产气

10％盐胨水

蔗糖

+/-

山梨醇

九、噬菌体-生物分型：

1.古典型和Eltor分型：

☞目前仍依靠第IV组霍乱噬菌体常规稀释液（106/毫升）裂解试验、多粘菌素B敏感试验、鸡血球凝集、V-P和溶血试验进行两种生物型的鉴别仅作参考。

☞埃尔托型已出现大量非溶血菌株，因此溶血试验已不能作为区别两个生物型的主要方法。

O1群霍乱弧菌古典型和El-Tor生物型的鉴别

鉴别试验

O1群霍乱弧菌生物型

古典型

埃尔托型

1.第IV组VC噬菌体（106/ml）

＋

－（＋）

2.多粘菌素B敏感

＋

－（＋）

3.鸡血球凝集

－（＋）

＋（－）

4.V-P

－

＋（－）

5.溶血

－

＋/－

注：

括弧内为少数菌株结果。

鉴别试验

O1群霍乱弧菌生物型

古典型

埃尔托型

1.第IV组VC噬菌体（106/ml）

＋

－（＋）

2.多粘菌素B敏感

＋

－（＋）

3.鸡血球凝集

－（＋）

＋（－）

4.V-P

－

＋（－）

5.溶血

－

＋/－

注：

括弧内为少数菌株结果。

（1）噬菌体分型：

☞根据五株国内分离的5种弧菌噬菌体（VP1～VP5）将埃尔托型霍乱弧菌分成32个噬菌体型（见下表）。

方法：

利用双层琼脂平皿法进行噬菌体滴皿裂解试验。

噬菌体型

对分型噬菌体的敏感性

噬菌体型

对分型噬菌体的敏感性

VP1

VP2

VP3

VP4

VP5

VP1

VP2

VP3

VP4

VP5

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

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－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

（2）生物分型：

☞根据菌株的溶原性、对溶原噬菌体的敏感性、山梨醇发酵试验和溶血试验等四个生物学性状，将埃尔托弧菌分成12个生物型。

埃尔托霍乱生物分型表

生物型

生物学性状

溶原性

对溶源噬菌体敏感性

山梨醇快速发酵

溶血试验

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

埃尔托霍乱弧菌噬菌体-生物分型表

噬菌

体型

生物型

△

▲

十、O1群与O139群霍乱弧菌的鉴别：

鉴别试验

O1群霍乱弧菌

O139群霍乱弧菌

1.血清凝集

O1群多价

＋

－

O139群

－

＋

2.O/129敏感

10μg

＋

－

150μg

＋

－

3.第IV组VC噬菌体原液

＋

－

4.甲基红

＋

－

5.菌体荚膜

－

＋

十一、霍乱菌种的登记、保存、上送和管理:

1.霍乱菌株的登记：

@基层实验室所检获的阳性菌种及可疑菌种，均应作好菌株来源详细情况的登记工作,包括编号、被检人或物名称、菌株来源（病人、带菌者或外环境）、分离地点（地址）及初步鉴定结果（见省CDC“河南省霍乱监测方案”附表）,一式两份,一份自己保存,一份随菌种上送。

2.霍乱种株的保存：

-对初步鉴定的霍乱弧菌及可疑菌株（包括不凝集弧菌），均应接种半固体菌种管培养基，经37℃过夜培养，用胶塞或石蜡封口，室温保存，切勿放入冰箱，因霍乱菌种半固体的最佳保存环境是18～25℃（一般可存活4～5年）。

N霍乱弧菌在4℃～8℃以下极易死亡。

3.霍乱种株的上送：

菌、毒种的上送工作是程序，也是制度。

按照《中华人民共和国传染病防治法》、卫生部规定：

各疫点市（县）在本年度疫情结束后必须立即收集整理当地分离到的所有霍乱菌株和可疑菌株，认真登记、造册，连同菌种一并派专人（2人）护送上级市（地）CDC；市（地）防疫站收集、整理所辖市、县上送菌种后，再届时按毒菌种管理规定上送省CDC，最后由省CDC统一进行编号、登记、整理备案，并进行血清学、生化学及噬菌体-生物分型鉴定、药物敏感性测定后上报国家CDC

和卫生部。

4.霍乱种株的管理：

O相关法规：

《中华人民共和国传染病防治法实施办法》和卫生部菌种管理委员会制定的《中国医学微生物菌种保藏管理办法》。

O菌（毒）种的保藏由国务院卫生行政部门指定的单位负责。

O一、二类菌（毒）种的供应由国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。

三类菌（毒）种由设有专业实验室的单位或者国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。

O认真做好登记，统一编号，冻干保存，按期传代、鉴定，并作好有关检验记录。

在保存过程中发生菌、毒种变异或死亡，应及时上报科主任及主管部门。

O当地所检出的地方菌、毒株应及时上报，因工作需要暂时保留的菌、毒株也应按上级规定的时间进行销毁处理。

O新发现的菌、毒种，要做好原始记录，一并上报主管部门复核确认。

O使用一类菌（毒）种的单位，必须经国务院卫生行政部门批准；使用二类菌（毒）种的单位必须经省级政府卫生行政部门批准；使用三类菌（毒）种的单位，应当经县级政府卫生行政部门批准。

O一、二类菌（毒）种，应派专人向供应单位领取，不得邮寄；三类菌（毒）种的邮寄必须持有邮寄单位的证明，并按照菌（毒）种邮寄与包装的有关规定办理。

O未经上级主管部门批准，任何单位及个人不得以工作之便，进行国际间各类菌、毒种交流。

做好菌、毒种生物安全防范工作。

传染病的菌（毒）种分为下列3类

6一类：

鼠疫耶尔森氏菌、霍乱弧菌；天花病毒、艾滋病病毒（4种）；

6二类：

布氏菌、炭疽菌、麻风杆菌；肝炎病毒、狂犬病毒、出血热病毒、登革热病毒；斑疹伤寒立克次体SARS病毒（9种）；

6三类：

脑膜炎双球菌、链球菌、淋病双球菌、结核杆菌、百日咳嗜血杆菌、白喉棒状杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、破伤风梭状杆菌；钩端螺旋体、梅毒螺旋体；乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒（17种）。

国务院卫生行政部门可以根据情况增加或者减少菌（毒）种的种类。

十二、确诊报告:

☞至此霍乱弧菌整个的鉴定程序（血清学、生化学、噬菌体-生物分型、药敏）全部完成，该由省疾病预防控制中心向国家卫生部、CDC报告鉴定结果。

☞国家规定首例霍乱病人的病原菌必须立即做到确诊报告。

以后续发病例则可以先做到初步诊断，至疫情结束后再进行噬菌体-生物分型、药敏等试验。

☞最终确定报告霍乱名称应为：

例1：

O1群埃尔托型霍乱弧菌小川型1b。

例2：

O139群埃尔托型霍乱弧菌。

分子生物学技术应用：

（一）PCR/MPCR毒力基因检测；

（二）染色体DNA提取；染色体DNA限制性内切酶酶切图谱制备；

（三）核酸分子CT、16srRNA分子杂交；

（四）脉冲场电泳（PFGE）分子分型；

（五）限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA片段（RAPD）、重复基因组回复序列（Rep-PCR）、肠杆菌基因间重复一致序列（ERIC）、扩增片段长度多态性（AFLP）PCR分子指纹分析技术及扩增DNA测序等。

（一）PCR/MPCR诊断技术：

根据霍乱毒素亚单位毒力基因（ctxA）、古典生物型霍乱毒素协同调节菌毛A基因（C-TCPA）和El-Tor生物型霍乱弧菌不同的TCPA基因编码序列（E-TCPA），采用PCR/MPCR（多重PCR）技术可快速而准确检测霍乱弧菌的毒力基因。

2.方法：

⑴模板制备将菌落从平皿上取下,溶于三蒸水或直接从细菌的LB培养液中取出一部分煮沸10分钟,12000r/min离心30秒后,取上清直接用于PCR扩增。

⑵系统配制在0.2mlEppendorff管中按顺序加入下列成份:

三蒸水12.8μl,10×PCR缓冲液（含有100mmol/LTris-HClpH8.3,50mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2,0.1%（gelatin）2μl,dNTPs0.8μl（每种dNTP的终浓度为0.2mmol/L）,引物0.5μl×6（每种引物终浓度为0.5μmol/L）,模板DNA1μl，TaqDNA聚合酶0.4μl（1.2U）。

⑶扩增反应采用两步法进行PCR扩增,首轮循环94℃5分钟,68℃1分30秒；后续循环94℃30秒，68℃1分30秒（29个循环）;末轮循环72℃7分钟（扩增之前每管加一滴石蜡油）。

⑷结果检测扩增后的样品管中加入溴酚蓝载样液2μl,通过1.2%的琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙锭）与相应的标准分子量（Marker）一起电泳,电泳结束后,通过紫外灯观察结果并照相。

　　书中横卧着整个过去的灵魂——卡莱尔

　　人的影响短暂而微弱，书的影响则广泛而深远——普希金

　　人离开了书，如同离开空气一样不能生活——科洛廖夫

　　书不仅是生活，而且是现在、过去和未来文化生活的源泉——库法耶夫

　　书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者———史美尔斯

　　书籍便是这种改造灵魂的工具。

人类所需要的，是富有启发性的养料。

而阅读，则正是这种养料———雨果

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