荧光检测海水介质中的一氧化氮.docx

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荧光检测海水介质中的一氧化氮

荧光检测海水介质中的一氧化氮

刘春颖赵敏任春艳,杨桂朋李培峰韩洋

【摘要】基于2,3二氨基萘（DAN）与一氧化氮（NO）在海水介质中生成荧光性2,3萘酚三唑（NAT）来测定海水中NO。

确信了荧光法测定NO的条件（λex=383nm，λem=410nm）、温度和时刻对DAN捕集NO的阻碍，和DAN溶液对捕集NO的阻碍。

测得NO浓度与其荧光强度之间呈线性关系，线性范围～1400nmol/L，r=，P<;检出限1nmol/L（S/N=3）;相对标准误差%（14nmol/LNO）;不存在介质干扰。

一样条件下与NaOH为介质的荧光法相较，本方式将检出限提高了1个数量级。

结合吹扫捕集检测出青岛石老人（36°05′46″N;120°29′40″E）海水中NO浓度为±nmol/L，可用于监测硝普钠在海水中释放NO的规律。

关

【关键词】一氧化氮,海水，荧光，2,3二氨基萘

本文系国家自然科学基金（Nos.，）、山东省中青年科学家科研奖励基金（No.2007BS08015）、山东省自然科学基金，国家杰出青年科学基金（No.）和山东省科技进展打算资助项目

　　1引言

　　一氧化氮（NO）是一种化学性质特殊但具有重要环境效应的自由基，它是致使臭氧层损耗的重要因素。

自20世纪80年代，分子生物学的进展慢慢发觉和证明了NO是生物体内重要的信使分子和效应分子，在生命进程中起着重要作用。

研究说明，NO对浮游植物的生长有必然的阻碍，它可能是浮游植物（藻类）生长的信息因子[1～3];NO对海洋氮循环也会产生重要阻碍。

已成立了一些检测海水中NO浓度的测定方式，开展了NO的生物地球化学研究[4～6]。

但是，不管是采纳Nafion或Co（salen）/Nafion修饰电极，仍是商品化的NO微传感器，都不能真正实现现场测定海水中NO的浓度[4～6]。

本研究在2,3二氨基萘（2,3Diaminonaphthalene,DAN）能够捕集NO产生具有强荧光性的2,3萘酚三唑（2,3naphthotriazole,NAT）[7]基础上，成立了海水介质中直接测定NO的荧光法。

并将此方式应用于现场测定海水中NO浓度和动态监测硝普钠在微藻培育体系内释放NO的进程。

　　2实验部份

　　仪器与试剂

　　F4500荧光分光光度计（日本Hitachi公司）;UV2550紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）;全自动电子分析天平（中国Sartorius公司），精准度为mg;HPG280B型光照培育箱（哈尔滨市东联电子技术开发）;微量进样器（上海安亭微量进样器厂）。

高纯NO气体%,大连大特气体）;高纯N2气体%，青岛合利工业气体中心）;天然海水采自青岛近海，经μm醋酸纤维滤膜（上海医药工业研究院）过滤后利用;2,3二氨基萘（≥95%，GC）和二甲基甲酰胺（SigmaAldrich公司，美国）;N亚硝基乙青霉胺（美国WPI公司）;EDTA和硝普钠（SigmaAldrich公司）;NaOH和NaNO3（青岛市化学试剂厂）;NaH2PO3（连云港市化学试剂厂）;NaSiO3（成都化学试剂厂）;维生素B一、维生素H、维生素B12（广东汕头市光华化学厂）;所用试剂均为分析纯;实验用水为MilliQ水。

　　实验方式

　　NO的标准溶液在通风橱中，向2mL水中通高纯氮气除氧30min，再以每秒钟一个气泡的速度通入高纯NO气体30min后溶液达到饱和，其浓度为mmol/L，此饱和溶液可稳固保留3h[8]。

　　DAN溶液配制用二甲基甲酰胺配制10mmol/LDAN储蓄液，避光于冰柜中（-21℃）保留。

然后别离用水，10mmol/LNaOH溶液和过滤海水配制成40μmol/LDAN测定液。

别离用高纯氮气除氧30min后避光冷冻保留，利用前移至冷藏。

　　确信荧光测定条件对DAN捕集NO前后的溶液在紫外可见分光光度计上进行250～450nm吸收光谱扫描，找出不受DAN阻碍的NAT吸收峰;以此为激发波长进行400～500nm发射光谱扫描，找到测定NAT的最大发射波长;以此最大发射波长为激发波长进行350～400nm激发光谱扫描。

　　3结果与讨论

　　测定NO的荧光条件及其机理

　　对照海水介质中DAN捕集NO前后的吸收光谱（图1）可见，不受DAN阻碍的吸收峰在370和383nm。

别离以370和383nm为激发波长，找到测定NAT的最大发射波长为410nm;而以410nm为发射波长时，图1海水介质中DAN捕集NO前后的吸收光谱

　　Absorptionspectraof2,3diaminonaphthalene（DAN）inseawaterbeforeandaftertrappingNO找到测定NAT的最大激发波长为383nm，370nm处未见峰（图2）;λex=383nm时监测λem=410nm处的荧光强度具有较好的线性。

别离对NaOH和海水介质中DAN和NO混合溶液做λex=383nm时的发射光谱和λem=410nm时的激发光谱扫描。

结果说明，海水介质中生成的荧光物质与碱性条件下生成的荧光物质具有完全相同的发射和激发波峰位置。

确信荧光测定条件为：

λex=383nm，λem=410nm，扫描速度为2400nm/min，响应时刻s。

由图3可见，DAN捕集NO只有在碱性条件下才有强荧光，而海水介质明显优于NaOH溶液。

据文献[9，10]报导，DAN与NO结合只有在碱性条件下（pH11～12）才能产生强荧光的NAT（图解1），而且不受缓冲介质的阻碍。

海水本身确实是一个碱性缓冲体系（pH≈，因此无需加入碱液就能够产生强荧光的NAT，而且其荧光强度比碱性介质高。

有利于降低荧光法测定NO的检出限。

　　温度和时刻对DAN捕集NO的阻碍

　　在海水介质中别离进行了5，10，15，20和25℃下DAN捕集NO的反映，结果说明，温度对峰位置和荧光强度大体没有阻碍。

别离进行了NO不同浓度nmol/L～μmol/L）与40μmol/LDAN结合时刻的实验。

结果发觉，μmol/LNO与40μmol/LDAN结合达到稳固需要15min,一样条件下，μmol/LNO需要5min,14nmol/LNO需要2min，nmol/LNO在刹时即可达到稳固。

结果说明，DAN捕集NO的时刻受到NO浓度的阻碍，测按时必需给予充分的捕集时刻。

　　不管在水相仍是气相，NO都极易被氧化。

用高纯氮气对10mL40μmol/LDAN溶液进行除氧30min，然后进行捕集μmol/LNO的实验，结果其荧光强度与相同条件下未除氧的不同在测量误差范围内。

说明DAN溶液对NO的捕集可能绝大部份发生在NO被氧化之前。

因此本研究中DAN溶液没必要除氧，能够直接用于捕集NO。

　　对DAN溶液捕集NO的进程进行了明暗对如实验。

结果发觉，避光进行的捕集NO的实验荧光值专门快达到了稳固，而在光照条件下荧光值很不稳固。

其缘故是DAN溶液会受到光照的阻碍，同时，海水介质中亚硝酸盐在光照下会分解产生NO[11]。

因此本方式必需在避光条件下进行。

　　海水介质中荧光检测的线性范围、检出限、周密度和准确度

　　以λex=383nm，λem=410nm为测定条件，用微量进样器在10mLDAN溶液加入不同浓度NO，体系的荧光光谱如图5所示。

结果说明，本方式测量海水中NO的检出限为1nmol/L（信噪比S/N=3）;线性范围～1400nmol/L，线性回归方程为y=+（r=，P<。

而在相同条件下，NaOH溶液中NO的检出限为14nmol/L（S/N=3）;线性范围14～1400nmol/L，线性回归方程为y=+,（r=,P<。

因此，海水介质能降低荧光测定NO的检出限约1个数量级。

　　对海水介质中14nmol/LNO和40μmol/LDAN混合溶液进行荧光测定，平行测定11次，相对标准误差为%。

用N亚硝基乙青霉胺（SNAP）化学计量分说明放NO，制备NO标准溶液[12]：

将500mL水调剂pH9.0，溶解入5mgEDTA，用高纯氮气除氧30min后将mgSNAP加到混合液中。

所得溶液避光冷藏在冰箱中待用。

测按时将必然体积的SNAP溶液注入到海水中后进行荧光测定。

结果说明，以NO饱和溶液和以SNAP分解法配制的NO标准溶液所得测定结果大体一致。

　　海水介质中荧光检测NO方式的应用

　　硝普钠在海水中释放NO硝普钠（Sodiumnitroprusside,SNP）是一种常见的NO供体，观测它在海水中释放NO的规律，有助于明白得NO对海水体系中生物的作用及规律。

取100μmol/LSNP于2mLDAN溶液中，每5min持续测定DAN捕集NO后荧光强度的转变（即监测累计量），能够看到NO浓度有随时刻延长而增加的趋势（图5），证明在观测时刻内SNP可持续释放NO气体。

在500mL锥形瓶中加入培育微藻时的f/2配方溶液，加入100μmol/LSNP后，把锥形瓶放入光照培育箱（温度22℃，光照强度4500lx），然后持续取样检测锥形瓶内NO浓度的转变，结果发觉，100μmol/LSNP在海水中可持续释放NO气体8h，浓度维持在100～400nmol/L（图6）。

本实验重复了3次，规律大体一致。

　　对海洋生态系中NO浓度的检测由于NO是一个疏水性的易扩散简单小分子，因此当流动的惰性气体通过待测样品时，它很容易随流动气体扩散出样品溶液，进而被导入DAN测定液中。

故采纳吹扫捕集方式能够现场测定海水中NO浓度。

2020年11月12日13：

00在青岛近岸石老人（36°05′46″N;120°29′40″E）搜集多份水样，对现场海水（500mL）用高纯氮气进行吹扫1h，用10mL40μmol/LDAN溶液捕集NO，采纳上述荧光测定方式，检测出海水中NO浓度为±nmol/L。

通过这种吹扫捕集的方式还能够监测海洋生物培育体系中NO浓度的转变。

吹扫捕集前后同为海水介质，幸免了介质不同对NO浓度测定的干扰。

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