关于人鼠嵌合抗体制备的可行性.docx
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关于人鼠嵌合抗体制备的可行性
关于人-鼠嵌合抗体制备的可行性
一、概述
人-鼠嵌合抗体，即抗体的可变区来自鼠单克隆抗体，而恒定区则来自人的抗体。
它是通过从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞表达产生。
嵌合抗体既保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力，又大大减少了鼠源性在人体内的免疫原性，其半衰期明显延长，且在介导CDC及ADCC方面亦明显增强。
二、市场分析
附表是中国SFDA批准上市和进入临床的治疗型单抗药物
抗体名称
厂家
靶抗原
抗体类型
适应症
研发阶段
Muromonab-CD3
强生
CD-3
鼠源
抗移植排斥
批准上市
Rituximab
罗氏
CD-20
嵌合
B细胞非霍奇金淋巴瘤
批准上市
Trastuzumab
罗氏
HER-2
人源化
乳腺癌
批准上市
Basiliximab
诺华
CD-25
嵌合
抗移植排斥
批准上市
Trastuzumab
基因泰克
HER-2
人源化
乳腺癌
批准上市
OKT3
武汉生物制品研究所
CD-3
鼠源
抗移植排斥
批准上市
抗人IL-8单克隆抗体乳膏
东莞宏远逸士生物公司
IL-8
鼠源
银屑病
批准上市
重组人源化抗人表皮因子受体单克隆抗体注射液
百泰生物药业公司
人表皮因子受体
人源化
上皮源性肿瘤
批准上市
碘［131I］美妥昔单抗注射
成都华神集团，第四军医大学
鼠源
肝癌
批准上市
碘［131I］人鼠嵌合型肿瘤细胞核单克隆抗体注射液
上海美恩生物技术公司
嵌合
抗肿瘤
批准上市
重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体－抗体融合蛋白
上海中信国健药业公司
肿瘤坏死因子
人源化
银屑病和强直性脊柱炎
批准上市
鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体
济南天康生物制品公司
CD-3
鼠源
抗移植排斥
临床研究
注射用抗肾病综合症出血热病毒单克隆抗体（I型）
武汉生物制品所，第四军医大学
鼠源
出血热
临床Ⅲ期
抗人肝癌单抗Hepama 1
中科院细胞所
鼠源
肝癌
临床研究
抗乙型脑炎单抗
北京生物制品所，第四军医大学
鼠源
乙型脑炎
临床研究
注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白
上海美恩生物公司
嵌合
肿瘤
临床研究
目前国内上市的单抗药物有11个，其中5个是国外进口产品，我国上市的自行开发的治疗性单抗药物的有6个，处于临床研究阶段的有5个（表6）。
其中，武汉生物制品研究所抗肾移植单抗OKT3（注射用鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体），也是最早批准上市的国内自行研制的抗体，具有免疫抑制作用，可逆转对移植器官的排斥反应；由北京百泰生物药业有限公司与古巴合作开发的I类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体”（商品名：
泰欣生）于2005年4月11日获得国家I类新药证书。
这是我国批准的第一个人源化单克隆抗体药物，它的问世标志着我国在癌症靶向治疗和人源化抗体药物领域取得重大突破，该药主要用于治疗头颈部、食管、肺部、乳腺、结直肠等部位的上皮源性肿瘤；由第四军医大学、成都华神集团股份有限公司联合研制的碘［131Ｉ］美妥昔单抗注射液（商品名：
利卡汀），于2005年4月20日获得国家I类新药证书。
这是全球第一个用于治疗原发性肝癌的药物，也是我国第一个具有自主知识产权的抗体类药物。
三、应用
嵌合抗体目前主要用于药物治疗方面，与鼠抗相比，嵌合抗体既保留了鼠源可变的高亲和性，又具有人Fc段的多种免疫杀伤功能，从而大大降低了人抗鼠抗体反应的发生几率，改善了临床治疗效果，与其它小分子基因工程抗体相比，嵌合抗体作为完成的抗体分子，在体内半寿期更长，并具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。
四、技术路线
五、材料与仪器
1．材料
大肠杆菌DH5α，大肠杆菌感受态细胞，T-A克隆载体T-EasyVector，含信号肽及重链、轻链恒定区基因的质粒pAc-κ-CH3，分泌单抗的杂交瘤细胞，真核表达载体pcDNA3.1，小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0。
2．主要试剂
氨苄西林钠，限制性内切酶，T4DNA连接酶，TaqDNA酶，TrizolRNA提取试剂盒，反转录PCR试剂盒，琼脂糖，嗅化乙锭（EB），dNTPs，DNAMarker，DNA凝胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒，胎牛血清，无血清培养液，二甲亚砜（DMSO），转染试剂盒LipofectamineTM2000，MTX，抗原，羊抗人IgGFc片段-HRP酶标抗体。
3．主要仪器
低温高速台式离心机，恒温摇床，恒温水浴箱，水平式电泳仪，PCR扩增仪，紫外分光光度计，紫外透射仪，CO2培养箱，倒置显微镜，洁净工作台，酶标仪。
六、关键技术与方法
1．可变区基因克隆
1.1 RNA提取及反转录
取对数生长期的杂交瘤细胞株约107个细胞，按照TrizolRNA提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA，再进行RT-PCR扩增，回收纯化扩增产物备用。
1.2 扩增轻链、重链的V区基因
根据Orlandi等（1989）设计的扩增小鼠可变区基因的引物，以上述扩增产物为模板扩增抗体基因的可变区。
回收重链VH（约360bp）、轻链VL（约330bp）片段，插入T-easy载体，各送3份样品测序。
测序所得序列在GeneBank核酸数据库中进行分类及同源性分析。
两端加入酶切位点
根据上述PCR产物序列设计含酶切位点的引物，再次进行扩增，以使抗体可变区基因片段具有与载体相吻合的酶切位点，便于插入表达载体。
回收纯化扩增产物备用。
2．嵌合抗体表达载体构建
改造含信号肽及人Ig重链和轻链C区基因片段的单克隆位点
设计含重链信号肽起始位点序列及酶切位点NheⅠ的上游引物HLF（KOZAK+4G，即GCCGCCATGG），和含XhoⅠ位点的下游引物HLR，以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出重链信号肽基因片段；设计含XhoⅠ和KpnⅠ位点上游引物HCF，和含Furin（RKRR）序列及酶切位点XbaⅠ的下游引物HCR，以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出重链恒定区基因片段片段；用XhoⅠ连接上述片段得到含重链信号肽、MCS及重链恒定区的基因片段。
设计含酶切位点ApaⅠ的上游引物LLF，和含EcoRⅠ位点的下游引物LLR，以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出轻链信号肽基因片段；设计含EcoRⅠ和HindⅢ位点上游引物LCF，和含PmeⅠ的下游引物LCR，以质粒pAc-κ-CH3为模板，扩增出轻链恒定区基因片段片段；用EcoRⅠ连接上述片段得到含轻链信号肽、MCS及轻链恒定区的基因片段。
构建含信号肽及人Ig重链和轻链C区基因片段表达空载体
用合成的含酶切位点（XbaⅠ和ApaⅠ）的2A序列连接上述重、轻链，得到含信号肽及人Ig重链和轻链C区基因的基因片段LigC（Leader+IgConstant）。
然后与NheⅠ和PmeⅠ双酶切过的pcDNA3.1-CA大片段连接，即得到嵌合抗体真核双表达载体pcDNA3.1-CA（chimericantibody,CA）。
pcDNA3.1图谱
插入含鼠源Ig重链和轻链V区基因
双酶切表达载体pcDNA3.1-CA和纯化的VL，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段后,连接、转化大肠杆菌，筛选出pcDNA3.1-CA-VL阳性克隆，富集培养后提取质粒进行酶切鉴定。
然后，双酶切表达载体pcDNA3.1-CA-VL和纯化的VH，分离纯化相应的酶切片段，重复上述步骤，构建成重组表达载体pcDNA3.1-CA-XX（抗原单词的首字母）。
3．转染Sp2/0细胞
接种适量Sp2/0细胞于培养瓶中，培养12h后用纯化的载体pcDNA3.1-CA-XXDNA,采用Lipofectamine2000试剂转染，按试剂盒使用说明书进行。
设置空载体和无载体的细胞为对照。
转染72h后，加含MTX的选择性培养基进行筛选。
2周后将生长出的阳性克隆利用有限稀释法单克隆化。
4．阳性克隆鉴定与筛选
以间接法用抗原和酶标羊抗人IgGFc片段抗体检测嵌合抗体的特异性及重组性。
以适量抗原包被酶标板，加细胞培养上清反应后，再加羊抗人IgGFc片段-HRP酶标抗体（经鼠Ig吸附过）孵育，显色后测A490吸光值。
5．抗体腹水生产
腹腔种植转染瘤细胞，5~7天后抽取腹水。
一只种植杂交瘤细胞的小鼠有时可产生多达10ml的腹水。
报道称从腹水中获得的嵌合抗体产量可达1~2mg/ml。
七、时间及成本预算
表1时间预算
项目
时间（周）
载体构建（外包，一次性）
8
杂交瘤细胞培养
0.5
RNA提取与反转录
0.5
引物合成
1
V区基因扩增与克隆
2
V区基因测序
1
插入表达载体及鉴定
2
表达载体扩增与抽提
1
转染Sp2/0细胞与筛选
3
嵌合抗体检测与筛选
1
总计（FirstTime）
20
表2成本预算
项目
费用（元）
感受态细胞
T-EasyVector
载体构建（外包）
T4DNA连接酶
TaqDNA酶
限制酶
TrizolRNA提取试剂盒
反转录PCR试剂盒，
琼脂糖，
dNTPs，
DNAMarker
DNA凝胶回收试剂盒
质粒抽提试剂盒
转染试剂盒LipofectamineTM2000，
筛选剂MTX
羊抗人IgGFc片段-HRP酶标抗体
低温高速台式离心机
水平式电泳仪
PCR扩增仪
紫外透射仪
恒温摇床
引物合成
测序
其它耗材
总计（FirstTime）
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