微流控芯片电泳免疫法检测β2微球蛋白.docx

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微流控芯片电泳免疫法检测β2微球蛋白

微流控芯片电泳免疫法检测β2微球蛋白

【摘要】目的：

建立一种基于微流控芯片电泳技术的快速微量蛋白检测方法。

方法：

用过量FITC-β2-MG抗体,与分析体系中β2-MG发生非竞争性免疫反应，FITC-β2-MG抗体和免疫反应形成的荧光免疫复合物通过微流控芯片电泳实现分离，激光诱导荧光检测荧光信号。

结果：

分别考察了电泳缓冲体系、pH值等对芯片电泳行为的影响，结果表明、45mmol/LTBE缓冲液分离效果较好，在此基础上实现了β2-MG标准品的分析，建立了微流控芯片电泳免疫分析方法。

结论：

微流控芯片电泳免疫分析方法可在2min内完成一次样品的电泳分析,且试剂和样品消耗少，灵敏度高，改善了常规免疫分析的不足，显示出较好的应用前景。

【关键词】微流控芯片；毛细管电泳；激光诱导荧光；β2微球蛋白

Microfluidicelectrophoresisimmunoassayforβ2-microglobulindetection

[Abstract]Objective:

Toestablishamethodtodetectmicro-volumeproteinbasedonmicrofluidicchipelectrophoresisandimmunoassay.Methods:

Anon-competitiveimmunoassaywasperformedbasedonmicrofluidicchipelectrophoresis.UsingFITClabeledβ2-microglobulinantibodytocaptureβ2-microglobulininsample,excessiveFITClabeledβ2-microglobulinandimmune-complexwereseparatedanddetectedbymicrochipcapillaryelectrophoresiswithlaserinducedfluorescence.Results:

Afterstudyingtheseparationanddetectioninfluencefactorsincludingelectrophoresisbufferconditions,pHvalue,wegottheexcellentelectrophoresisconditionwas,45mmol/LTBEbuffer,600V/cmseparationelectricfielde,Basedonthiselectrophoresiscondition,thestandardβ2-microglobulindetectionwassuccessfullyperformed.Conclusion:

Microfluidicchipbasedelectrophoresisimmuneassayformicro-volumeproteindetectionwasintroduced.Thedetectionandanalysisprocesswasperformedwithin2minuteswithlesssampleconsumingandhighsensitivity.Itsimultaneouslyovercametheshortageofroutineimmunoassay.

[Keywords]Microchip;Capillaryelectrophoresis;Laserinducedfluorescence;β2-microglobulin

尿微量蛋白是尿中某些蛋白的排泄呈亚临床升高，而常规方法难以检测的一种病理现象，当尿中出现微量蛋白，可反映肾脏结构与功能的轻度或早期受损[1]，对β2微球蛋白的检测可用于早期肾小管损伤的监测。

毛细管电泳免疫分析（capillaryelectrophoresisbasedimmunoassay，CEIA）较传统蛋白检测方法简便、快速，但仪器昂贵，从而限制了在临床的应用推广。

微流控芯片具有微型化、集成化、分析速度快、试剂消耗少等显着优点，已经在免疫测定、DNA分析和测序、氨基酸和蛋白的分离[4~6]以及生物细胞研究[7,8]等方面发挥出优势。

本研究将CEIA和微流控芯片相结合，采用高灵敏度激光诱导荧光检测，用于β2-MG标准品的分析，在优化了缓冲体系成分和pH值等参数的基础上，实现了β2-MG的快速分离和分析，有关临床研究将另文报道。

该法比传统免疫及单毛细管方式检测蛋白有更多优势：

分析速度快，效率高，样品用量少，检测限低，是今后用于尿液中微量蛋白检测分析最具潜力的方法之一。

1材料与方法

　材料

　微流控芯片在50mm×50mm×1mm的石英玻璃上，利用标准光刻、湿法腐蚀和键合技术制造微流控芯片，由四个储液池和十字管道构成，其中样品池到十字交叉点长5mm，有效分离长度为40mm，储液池直径为mm，微管道宽约100μm，深约40μm。

　激光诱导荧光检测仪根据共聚焦原理构建的激光诱导荧光检测系统[10]，氩离子激光器发出波长为488nm的激光束，经半反半透镜反射至物镜，由物镜聚焦对准芯片微管道检测窗口；当微管道内FITC标记的蛋白经过时将激发出520nm荧光，激发出的荧光由物镜收集，通过半反半透镜，经光电倍增管，10mmol/L磷酸盐缓冲液缓冲液实验前新鲜配制，FITC标记的β2-MG抗体，人β2-MG，三羟甲基氨基甲烷、硼酸、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甘氨酸等试剂均为分析纯，实验用水为去离子水，试剂使用前用μm滤膜过滤。

　　　实验方法实验前芯片管道清洗程序：

去离子水冲洗5min→抽干→mol/LNaOH冲洗2min→抽干→去离子水冲洗5min→抽干→缓冲液冲洗2min→抽干→缓冲液注入微管道；实验后芯片管道清洗程序：

各储液池抽干→去离子水冲洗5min→抽干→mol/LNaOH冲洗2min→抽干→去离子水冲洗5min→抽干→10%SDS浸泡2min→抽干→去离子水冲洗5min→抽干。

电泳分析时，将FITC标记的β2-MG抗体与适量β2-MG孵育物加入样品池，进样时，样品池加500～700V电压30s，样品废液池接地，缓冲液池和缓冲液废液池悬空，在电渗流的作用下，试样从样品池经过十字交叉口流向样品废液池；分离时，缓冲液池加+2000～3000V，缓冲液废液池接地，样品池和样品废液池悬空，存储在十字交叉口处的一段试样溶液在电渗流的推动下进入分离通道进行分离。

在碱性条件下，蛋白虽带负电荷，但当电渗流的力大于电荷作用力时，蛋白分子向负极泳动，且分子越小、带负电荷越多的蛋白泳动越慢。

2结果

　缓冲体系的选择实验中比较了TBE、磷酸盐缓冲液和Tris-甘氨酸的分离效果，结果表明45mmol/L的TBE缓冲液基线平稳、出峰较稳定、峰形好。

　pH的优化实验优化了pH～浓度45mmol/L的TBE缓冲液对分离的影响。

pH时，约60s出峰；时，约40s出峰；pH和pH时，约35s出峰，随着pH的升高，出峰时间相应提前。

　β2-MG的检测用pH、45mmol/LTBE电泳缓冲液分别检测了FITC-β2-MG抗体及其免疫反应混合物。

FITC-anti-β2-MG在45~60s时出峰，FITC-anti-β2-MG过量时的免疫反应混合物电泳时，分子较大的免疫复合物在35～50s出峰，当抗原β2-MG过量时，免疫反应混合物电泳主要检测出免疫复合物的双峰。

3讨论

不同缓冲体系不仅影响蛋白带电性和电渗流的大小，而且会影响背景信号的高低，从而影响样品的分离度和检出限。

由于微流控电泳芯片的通道比较细，PBS在电泳过程中易析出磷酸盐结晶从而堵塞芯片；Tris-甘氨酸分离电流不稳定，从5~60mA快速变化，变异较大，出峰不稳；TBE缓冲液电泳时基线较平稳、出峰亦稳定、峰形重复性好。

缓冲液的pH影响微通道管壁的电荷和蛋白所带电荷的多少，从而可改变EOF速率和蛋白质迁移率[11]，蛋白在酸性溶液中易变性，故蛋白电泳大多用偏碱的缓冲液，同时pH还影响蛋白在微通道管壁的吸附程度和免疫复合物的稳定性，因此碱性又不能太强。

因此选择在pH～范围内进行优化，随缓冲液pH的升高，管道内形成的电渗流逐渐增大，蛋白向负极泳动的速度也加快。

pH和pH的出峰时间相似，可能因为随pH的不断增大，硅羟基的解离渐趋于最大，电渗变化逐渐放平缓；同时pH时蛋白带负电荷相应减少，与带负电的毛细管壁的静电斥力减小，引起蛋白质吸附和相应的峰扩展，检测到的信号弱。

缓冲液的pH较大时，对蛋白和免疫复合物的稳定性影响较大。

由于微流控芯片电泳与普通区带电泳的原理不完全一样[12]，微流控芯片主要以电渗流作为蛋白区带的驱动力，在碱性条件下，当电渗流的力大于电荷作用力时，蛋白分子向负极泳动，且分子越小、带负电荷越多的蛋白泳动越慢。

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