生化实验报告肝糖原测定.docx
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生化实验报告肝糖原测定
生化实验报告-肝糖原测定
生物化学实验报告
姓
名：
学
号：
专业年级：
组
别：
___
实验教学中心
第一部分
一、实验目的
掌握程度实验主要目的
1.
掌握肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法
2.正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器
3.熟练运用溶液混匀的各种方法（试情况而定，采用合适的混匀方法）
4.正确掌握溶液转移的操作
5、正确操作使用分光光度记二、实验原理
掌握程度实验内容及原理实验名称
肝糖原的提取、鉴定与定量
实验时间
___
实验地点
___
指导老师
赵___
组员
___
评分
批改日期
肝糖原的提取与鉴定
糖原储存在细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其他成分分离开来。
糖原不溶乙醇而溶于热水，故先用95%的乙醇将滤液中的糖原沉淀，再溶于热水中。
糖原水溶液呈现乳样光泽，遇碘变红棕色。
这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。
糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判断肝组织中糖原的存在。
CuSO4+2NaOH=Na2SO4+Cu（OH）22Cu（OH）2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O2CuOH=Cu2O（红色）+H2OCu（OH）2=CuO（黑色）+H2O
肝糖原定量测定
糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物;5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色化合物。
该物质在620nm处有最大吸收。
糖含量在10~100ug,溶液颜色的深浅可与可溶性糖含量成正比。
利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，可得到样品中糖原的含量。
糖原在浓碱溶
液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。
一、
材料与方法
1、实验材料样品
鸡肝
试剂
肝糖原的提取与鉴定：
95%乙醇，0.31mol/L（5%）三氯醋酸溶液，浓盐酸，NaOH溶液，碘试剂,班氏试剂。
肝糖原定量测定：
30%KOH溶液，0.5mg/ml的葡萄糖溶液，蒸馏水，蒽酮显色剂。
仪器和器材
可见光分光光度计，恒温水浴箱，试管架，三支试管，加样枪，加样枪架，普通离心机，研钵，刻度吸量管，白瓷反应器，100ml容量瓶。
2、实验流程肝糖原的提取与鉴定：
鸡肝约1.5g，剪碎＋5%CCl3COOH1ml研磨至乳状＋5%CCl3COOH3ml研磨成肝匀浆
全部转入离心管中，离心3分钟（4000r/min）
沉淀（弃去）
上清（取3ml）
＋3ml95%乙醇，混匀，静置10分钟
离心5分钟（4000r/min）
上清（弃去）
沉淀＋蒸镏水1ml沸水浴2分钟，溶解沉淀
白瓷板孔穴中
糖原溶液1ml＋浓HCl5滴加碘试剂2滴
加碘试剂2滴
沸水浴15分钟，冷却糖原溶液2滴
＋50%NaOH5滴
呈色对比
糖原水解液2滴
糖原水解液＋班氏试剂4滴混匀
沸水浴2分钟，观察变化
肝糖原定量测定
鸡肝0.15g＋30%KOH1.5ml
沸水浴15分钟
冷却，全部转入100ml容量瓶中
加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液
糖原的测定
取3支试管，按下表操作。
试剂（ml）
空白管标准管样品管蒸馏水1.0;;标准葡萄糖溶液;1.0;糖原提取液;;1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5混匀，沸水浴10分钟，冷却c。
在分光光度计620nm波长处，用空白管溶液调
零，测定各管溶液的吸光度（A）。
4、注意事项肝糖原的提取与鉴定①在提取肝糖原中，向上清液中加入乙醇后，要充分混匀，可以用玻璃棒搅拌。
②糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基的多少有关。
肝糖原分支中葡萄糖残基在20个以下，吸附碘后呈现红棕色。
肝糖原定量测定
①肝组织必须在沸水浴中完全溶解，否则影响比色；②注意要收集全部溶液，用水多次洗试管，一并收入容量瓶中；③加入蒽酮溶液时要小心操作，将试管放在试管架上进行；④如果溶液呈浑浊，则因配制蒽酮溶液的硫酸浓度不够所致。
第二部分
一、实验结果与处理
1、实验现象操作过程现象图片
（11）鸡肝在三氯醋酸中，被研磨成肝匀浆
（2）鸡肝研磨成肝匀浆后转入试管
（33）第一次离心后
（44）第一次离心后上清液转移到另一试管
（55）第二次离心后
（66）第二次离心后的沉淀
（77）沸水浴使沉淀溶解后
（88）糖原水解液
（99）班氏试剂与糖原水解液反应：
溶液显蓝色，砖红色不明显
（10）
白瓷板孔穴中糖原与碘反应（左边为碘试剂与肝糖原溶液，右边为碘试剂）:
:
紫色不明显
（11与）鸡肝与30%的HNaOH溶液混合在沸水浴中加热后:
:
呈血红色
（12）糖原溶液装入L100mL容量瓶混匀后：
刻度线处有些许气泡，混匀过程造成
（13）糖原提取后的测定
，三支试管水浴后（11、22、33号试管分别为空白管、标准管、样品管）：
三只试管水浴10min后，标准管颜色最为明显，为绿色，加入的是标准葡萄糖溶液，样品管与空白管颜色依次递减。
2、实验数据记录在分光光度计620nm波长处，测定各管溶液的分光度（A），记录结果如下：
各管吸光值测定次数
空白
标准
样品1
0.000
0.350
0.010
2
0.000
0.351
0.011
3
0.000
0.353
0.013
3、实验结果
肝糖原的提取与鉴定：
显色反应中，碘液由黄色变为红棕色（不明显），说明所提供材料中含糖原成分，但含量低；加入班氏试剂的溶液无明显的颜色变化； 肝糖原定量测定
（1）鸡肝所取质量：
0.15g
（2）各管吸光值
各管吸光值测定次数
空白
标准
样品1
0.000
0.350
0.010
2
0.000
0.351
0.011
3
0.000
0.353
0.013
平均值
0.000
0.351
0.011
标准管吸光度平均值0.351；样品管平均吸光度0.011； 由公式计算：
11.
1_1000100_g100_
05.
0_
100/g）
肝组织重（标准样品肝组织）
肝糖原（AAg注：
1.11为此法测得的葡萄糖含量换算为糖原含量的常数，因为用蒽酮试剂显色时，110ug糖原与100ug葡萄糖显色程度相当。
故经计算最后结果为0.116（g/100肝组织）。
4、讨论与分析
（1）与碘试剂反应时：
加入糖原的孔穴并没有出现明显的红棕色。
可能原因如下：
A、是在取糖原沉淀时，沉淀很少，糖原含量也很少；B、碘试剂本身是黄色的，本来现象就不是很明显，这样一来，几乎看不到反应会产生的红棕色了，说明糖原含量极少。
（2）糖原中葡萄糖的鉴定：
实验结果也没有如预期中的蓝色溶液沸水浴后变为砖红色。
原因如下：
A、沸水浴过程水温没有达到100摄氏度，且期间多个小组先后放、取水浴箱中的试管，对反应造成一定影响；B、糖原含量极少，又加过少量酸与碱，浓度更小，现象更不明显，所以观察不到明显的砖红色。
（3）在肝糖原定量测定中，由资料可知饱食鸡肝的肝糖原含量为：
2～3g/100g肝组织。
而我们的结果明显偏低，实验中没有出现操作上的失误，讨论分析原因如下：
A、所用鸡肝来源并非饱食鸡的肝，且鸡肝每个部位肝糖原的含量有差异，与其他实验组对比，可能我们组所取鸡肝的部位刚好是肝糖原含量较低的部位；B、查资料得知若肝糖原含量<1％时，蛋白质会干扰蒽酮反应，这可能对实验结果进一步造成降低的影响。
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