微载体.docx

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微载体

微载体microcarrier定义：

细胞培养中所使用的一类无毒性、非刚性、密度均一、通常是透明的小颗粒。

能使依赖贴壁的细胞在悬浮培养时贴附在颗粒表面单层生长，从而增加细胞贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。

是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。

一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。

原理与操作1.原理：

其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。

贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。

细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。

黏附主要是靠静电引力和范德华力。

细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。

2.搅拌转速：

由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。

通常的操作方式是：

在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。

微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。

3.细胞与微载体的相融性，是与微载体表面理化性质有关。

一般细胞在进入生理PH值时，表面带负电荷。

若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。

若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。

三个方面

●在细胞方面，如细胞群体、状态和类型。

●在微载体方面，如微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。

●在培养环境中，如培养基组成、温度、pH、DC以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。

如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。

　　5.微载体培养操作要点

　　●培养初期：

保证培养基与微球体处于稳定的PH与温度水平，接种细胞（对数生长期，而非稳定期）至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。

不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的。

常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。

　　●贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。

　　●培养维持期：

进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。

随意细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。

经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液：

停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37℃），重新开始搅拌。

　　●收获细胞：

首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min。

然后解离收集细胞及其产品。

●微载体培养的放大：

可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。

使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L以上。

生物反应器系统

此技术大规模培养，细胞扩增的效率受到诸多因素的影响和限制，其中主要的限制性因素包括：

细胞对剪切力的敏感性、氧的传递以及传代和扩大培养等。

而研制的各种类型生物反应器系统则可针对上述限制性因素，为微载体细胞培养与扩增提供低剪切力、高氧传递效率、易于细胞传代等适宜的外部环境。

已较多使用的微载体培养系统生物反应器，可以实行计算机控制操作，培养搅拌速度及悬浮均匀程度、温度变化、PH稳定及溶氧供应（O2、N2、CO2、空气四种纯化气体按比例调节）、罐压、培养体积和通气量等参数全部由电脑自动控制。

因此，应用生物反应器系统进行微载体细胞大规模扩增具有明显优势，目前国外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统，如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统以及灌注式生物反应器系统等。

搅拌式生物反应器系统拌式生物反应器系统在微载体细胞大规模扩增研究领域已有较长的研究历史，但因该细胞培养系统容易产生过大的剪切力，从而限制了其应用范围。

尽管如此，由于该系统具有简单、实用及价格低廉等特点，国内外仍有不少应用该系统成功进行细胞大规模扩增的研究报道。

例如，WernerA（2000年）成功地在该系统内进行了肝细胞大规模扩增的研究。

灌注式生物反应器系统流培养是目前研究热点之一。

它的特点是不断地加入新鲜培养基以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗培养基，使细胞得以在一个相对稳定的生长环境内增殖，即省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，且可以提高细胞密度10倍以上。

旋转生物反应器近年来，旋转生物反应器系统（RCCS）已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统。

该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器。

RCCS既可以用于微载体大规模细胞培养，又能在其内培育细胞与支架形成的三维空间复合体。

至今，近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。

微载体培养优点

　　●表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高；●把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；●可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；●简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；●培养基利用率较高；●放大容易；●细胞收获过程不复杂；●劳动强度小；●培养系统占地面积和空间小。

一．微载体规模化培养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研究*

（1）MDCK细胞在3个浓度微载体（2g/L,5g/L,10g/L）上的生长曲线。

结果见图2.3个浓度的微载体上生长的细胞在接种5d后数量达到最高,密度分别为4.07@105个/mL,3@106个/mL,2.58@106个/mL。

其中投放低浓度微载体（2g/L）的转瓶由于微载体数量少,生长的细胞总数较少;投放中浓度（5g/L）微载体的转瓶中微载体上生长的细胞数量最多,生长速度也最快;投放高浓度（10g/L）微载体的转瓶中由于微载体数量过多、培养过程中相互聚集、碰撞,导致死细胞数量增加。

（2）微载体是指直径在60-250Lm,适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠。

微载体能成为迄今最常用最有效的动物细胞培养载体,是因为它具有以下优点:

比表面积大;兼具单层培养和悬浮培养的优势;易于检测和控制培养系统环境因素和微珠上细胞的生长情况;培养基利用率高,易于培养放大;提供了更近于体内环境的三维立体环境。

MDCK细胞是贴壁生长细胞,可应用于微载体大规模培养,进行定量研究。

（3）利用微载体培养细胞,所用培养瓶需要加入一定浓度的硅化剂进行硅化,以保证微载体悬浮在培养液中。

试验中发现若培养瓶硅化不彻底,微载体便会贴附在未被硅化处,使该处细胞无法附着;另外大量微载体紧密贴附在未被硅化部位,微载体表面的细胞也会由于接触抑制发生脱落。

本试验利用50%甲基硅油乙酸乙酯溶液,均匀硅化30min,即可达到很好的硅化效果。

本研究发现当微载体使用浓度为2g/L时,由于其浓度过小会增加传代次数,不符合生产经济性;但当微载体浓度增加到10g/L时,由于微载体数量过多,培养过程中微载体相互聚集、碰撞,使死细胞数量增加,同时为维持细胞高密度生长,避免培养液营养消耗过快,代谢产物累积过大,就必须频繁更换培养液。

因此本研究选择的最佳微载体浓度为5g/L。

二．猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞微载体上培养条件的研究

（1）玻璃器皿的硅化备用的玻璃器皿先用自来水冲洗干净，烘干后再放入清洁液中浸泡24h，取出后用自来水冲净，再用双蒸水洗3次后置烘箱中干燥；将干燥后的玻璃器皿放入通风厨中，取少量的硅化液（二甲基二氯硅烷的氯仿溶液）加入到干净的玻璃器皿中，润湿所有可能接触到微载体的表面，将多余的硅化液从器皿中倒出，然后将其晾干。

玻璃器皿用蒸馏水彻底地冲洗（至少2次）并高压蒸汽灭菌。

（2）微载体Cytodex-3预处理预处理好的CT-3如图1所示，外表光滑，呈悬浮状态。

图1Cytodex-3载体

细胞接种密度测定各组细胞接种密度分别为：

A组-4.28×105cells/mL；B组-1.70×

105cells/mL；C组-2.31×104cells/mL；C组补偿接种细胞密度-1.72×105cells/mL。

具体方法：

1.玻璃器皿的硅化2.Cytodex-3微载体预处理3.微载体细胞培养--接种细胞;细胞培养：

A组，B组

接种细胞：

克氏瓶中细胞经ET消化后，营养液悬浮细胞，细胞计数后，将细胞加入微载体中，补加营养液至终体积的1/3。

微载体培养终体积为400mL，将接种了细胞的Celstir双侧臂细胞生物反应器放至37℃温箱中的Micro-Stir

低速磁力搅拌器上。

（3）Marc-145细胞在微载体Cytode×-3上的生长情况接种Marc-145细胞24h后，显微镜下可见，A组中微载体上已全部长满Marc-145细胞（图2）；B组中部分微载体上已长满Marc-145细胞，但仍有部分微载体上未长满或仅有几个细胞贴壁，甚至出现空球（图3）；C组中微载体上仅有个别细胞贴壁，且空球较多（图4），但在补接种细胞后24h，C组中大部分微载体上已长满细胞，但仍有部分微载体上细胞未长满（图5）。

图2A组接种后24小时Marc-145细胞的生长状态图3B组接种后24小时Marc-145细胞的生长状态

图4C组接种后24小时Marc-145细胞的生长状态图5C组补偿接种后24小时Marc-145细胞的生长状态

细胞的微载体技术是动物细胞培养中最先进的技术之一，为细胞的大量生产提供了可能，即可从小的培养体积得到高产量的细胞。

本实验在3mg/mL微载体浓度条件下，研究4.28×105cells/mL，1.70×105cells/mL，2.31×104cells/mL和1.72×105cells/mL的细胞接种密度对细胞在微载体上生长的影响，结果表明在微载体浓度相同条件下，细胞接种密度不宜过低，否则细胞很难贴满微载体，导致空球率较高，最终会影响病毒液滴度。

三．微载体cytodex3大量扩增成人骨髓间充质干细胞的初步研究

我们通过微载体cytodex3培养和普通单层TCPS培养的比较发现,hMSCs在cytodex3表面能良好的黏附、贴壁和保持活跃的生长状态,同普通TCPS单层培养时相同。

MTT检测表明hMSCs常规的TCPS单层培养时,在接种后第6天后进入衰退期,而cytodex3表面的在第9天时仍处于对数生长期,FCM检测两者的细胞表面表型和细胞周期分布无明显差异,表明hMSCs在微载体cytodex3表面保持着较高的增殖活性且不影响其正常表面表型。

这是因为cytodex3培养是一种悬浮状态培养,培养的细胞混合更加均匀,细胞生长状况均一,同时cytodex3提

供了较大的比表面积,从而能够有助于减少传统单层培养时的接触抑制。

普通25cm%25cm细胞培养瓶hMSCs细胞数约为4%105,而我们在同样容量的细胞培养瓶中通过cytodex3获得了5%106细胞,提高了10倍,如果增加微载体的数量和结合旋转培养瓶将能获得更大数量级的hMSCs。

在hMSCs普通的单层贴壁培养体系中,由于细胞间的接触性抑制,细胞生长速度变慢,需要频繁消化传代,大量培养时不仅工作量巨大,而且难以避免出现污染,难以实现肝细胞移植和生物人工肝的治疗所需得的1%1010级细胞数。

在实验中,普通的TCPS培养瓶细胞的传代需要胰酶和EDTA消化传代,对细胞有较大的损伤,从而有较长的适应期,而微载体cytodex3表面培养时,hMSCs的传代,可以简单地加入新的cytodex3辅以轻微地机械吹打即可完成,避免了细胞普通消化传代时trypsin和EDTA对细胞的损伤,使传代细胞的潜伏期缩短,有助于细胞的快速生长,同时细胞的收获也变得简洁。

综上所述,我们认为微载体cytodex3培养技术可以很好地用来大量扩增hMSCs,并能保持其良好的增殖活性,为hMSCs的大规模培养在组织工程学和细胞治疗中的研究提供了实验基础。

四．生物反应器培养Vero细胞的生长代谢与限制因素研究

（1）其中Vero细胞在微载体表面的Vero贴壁过程是细胞生长的关键细胞贴附至微载体的表面受到许多因素的影响,这些因素包括微载体表面特性,培养及组成以及pH、细胞生理特性和培养环境混合强度等。

微载体在正常的生理状态下,细胞表面带有不均匀的负电荷,因此它贴附到带有负电荷表面时需要二价阳离子或吸附蛋白作为桥梁在细胞与微载体之间形成“细胞—桥—微载体”的结构模式。

当细胞贴到带有正电荷的载体表面时则无需这种桥的结构,此时,在培养基中添加血清反而会降低细胞的贴附速度。

细胞贴壁速度的快与慢直接影响到细胞能否快速进入生长期,在培养过程中表现为细胞贴壁慢延滞期长,贴壁快延滞期短,因此有必要对选定培养系统的生长过程进行详细的研究。

对于生物反应器的培养系统（细胞微载体培养基组成等）影响细胞贴壁速率的因素主要包括细胞的接种密度、微载体浓度、搅拌转速、细胞的生理状态等。

以前,大部分细胞贴壁研究主要集中于研究微载体的表面性能和培养基的构成成份对细胞贴壁速率的影响,而没有对上述工程因素进行系统的研究,因此未能有效地指导大规模工业化培养过程。

我们的主要目的便是系统地研究细胞接种密度、微载体浓度、搅拌转速及细胞生理状态对Vero在微载体表面贴壁速率的影响,以从工程学的角度考察细胞贴壁动态过程,揭示优化操作策略,指导工业化过程开发。

（2）A.细胞代谢周期　细胞接种后,通常第一天的细胞处于停滞期,这是细胞分裂繁殖前期的准备,以及

细胞贴壁所需的时间。

一方面,细胞逐渐适应新的环境。

另一方面,又要不断合成所需的前体,积累细胞分裂繁殖所需的活性物质,并使之达到一定的浓度,第二天,细胞进入对数生长期,第三、四天达到最高峰,并处于平衡期,随着细胞密度的增加,葡萄糖不断被消耗,乳液和氨也不断积累,到反应后期细胞死亡脱落。

　B.细胞生长代谢　细胞生长状态和普通方瓶和转瓶培养类似,当细胞贴壁微载体上后,进入对数生长期,在72h左右,细胞生长出现一个延缓期,在方瓶和转瓶培养时也都出现这种情况,这可能由于当细胞长满微载体表面后开始多层生长的一个适应期,营养成分在细胞内外扩散和交换的微环境发生了变化而导致这一现象。

这一现象也表明Vero细胞并没有严格的接触抑制现象。

而是在微载体边面和微载体之间形成多层生长。

五．微载体培养技术的研究进展郭燕华　郭　勇　罗立新

1967年VanWezel首先开发微载体培养动物细胞。

30多年来,微载体技术的研究随着动物细胞培养广泛的应用而深入,并得到了越来越多的应用。

1　微载体培养动物细胞的特点微载体是指直径在60—250μm,适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠。

微载体能成为迄今最常用最有效的动物细胞培养载体,除了由于许多病毒疫苗和重组蛋白仅可在贴壁依赖型细胞系生产的限制外,还因各类微载体共同具有的优点[1,2]:

比表面积大;易于检测和控制培养系统环境因素和微珠上细胞的生长情况;培养基利用率高;可实现无细胞过滤,优化下游工程;培养放大易,劳动强度大,可系统化,自动化,减少污染;提供了更近于体内环境的三维立体环境,细胞在微载体上可克服接触抑制,形成多层生长。

目前,在实际中应用广泛的是固体微载体,包括实心球体微载体和大孔微载体。

实心微载体易于细胞在微珠表面的贴壁、铺展和病毒生产时的细胞感染[3],放大过程中球转球接种工艺[4]。

其中Cytodex系列目前用途最广。

但实心微珠相对于利用微珠内部来培养细胞的大孔微载体比表面积和可获得的细胞浓度较小,细胞易受搅拌、珠间碰撞、流动剪切力等动力学因素破坏[5]。

大孔微载体可广泛用于填充床、流化床、搅拌釜生化反应器,且在灌流反应器中可保持数月的良好生产力,能在降低培养基血清含量的同时保证细胞和目的产物的产量[6,7];但它在空间上阻碍了氧等营养成分的传递和病毒的感染细胞,积累代谢废物[8。

鉴于固体微载体的不足,Charies等开发了氟碳化合物液膜微载体。

这种液体微载体的微珠形成、细胞贴壁、培养均在搅拌下进行,当达到培养目的时停止搅拌即可通过混合物的离心分相使细胞游离地悬浮于有机相和培养基相之间,用移液管即可方便移出[9],克服了固体微载体吸附血清、易于变性而仅可一次性使用,培养后的分离过程损失细胞等缺点。

2　过程优化载体的广泛应用促进了细胞贴壁过程、培养中新的监测方法和培养放大工艺等的研究,它们关系到生产整体可操作性、经济性,是微载体培养模式优化的重点。

2.1　贴壁于细胞生产与贴壁分别属于生物和物理两个性质不同的过程,影响这两个过程的因素就有了很大的差异。

2.1.1　微载体性质1）微载体的基质和修饰:

任何时候vero细胞Cultispher2G表面的相互作用都比与Cytodex21表面的相互作用低,因此对前者贴壁时要求血清补料[3];肝细胞在血清或纤连蛋白存在时可吸附于Cytodex21上,对Biosilon则要求载体被纤连蛋白包被,对Cyto2dex23则在血清是否存在时均可贴壁[10]。

（2）微载体表面的电荷密度和表面基因的疏水性:

由于细胞膜是与微载体表面的带电基因作用而贴壁的,部分微载体经DEAE修饰提高表面正电荷密度可提高细胞贴壁速率[11]。

但电荷密度过高是会危害细胞的,如改良前的Cytodex21正是由于电荷密度过高产生了损失接种细胞的“毒性效应”[1]。

Grinnell则发现增加微珠表面一级氨基荷电基因疏水性可提高细胞贴壁率[12]。

（3）微载体浓度:

一定微载体接种一定细胞有其最优珠荷载。

微载体浓度过小则不符合生产经济性,增加传代次数;浓度过大则造成一定接种细胞数量下载体的浪费或培养后期细胞生长营养不足[12]。

（4）接种过程中,胞珠间的吸附与胞间的凝集是同时存在而又可比的,对于大孔微载体,胞间凝集比实心微载体更明显。

为此,应针对不同微载体进行预温育等不同预处理[6],以使细胞贴壁率最大化,胞间相互吸附作用最小化。

2.1.2　接种水平种水平就是指接种阶段加入的细胞数与载体微珠量的比率,其优化目的是使已加入而未利用的微珠最少,可利用于细胞生长的总表面积最大,细胞均匀分布在微珠上,目的产物最大化。

一定细胞的可用接种范围很大,但存在最佳值,且使用较优培养基可使接种水平较小,这表明了除可利用表面积外,环境因素也影响接种水平[6,12]。

此外,保持恒定微载体量,连续改变加入的细胞数的实验表明贴壁细胞数存在一饱和点,之后再增加加入细胞数不会增加贴壁细胞。

饱和点上贴壁细胞占总加进细胞50%～80%,被涂布的微载体表面为50%～100%。

可见,接种水平与贴壁率或与最终细胞浓度的关系均是非线性的[10]。

2.1.3　搅拌方式

实心微载体接种时连续的低速搅拌是有效的,而且可以使细胞贴壁更均匀;但大孔微载体要求间歇搅拌。

这是由于当细胞与微珠表质的相互作用较弱时贴壁过程采用连续搅拌利于凝集,导致细胞在微珠上的低分布,而间歇搅拌中的静止状态使细胞能靠近微珠表面,保证了最佳的细胞贴壁分布[6]。

但大规模培养生产缺少搅拌（即使仅在初期或仅是间歇停止搅拌）会产生温度控制和对细胞供氧不足等问题,因此实际大规模生产中大孔微载体接种采用传统的沉降2混合操作并非最优[12],最优的搅拌方式仍有待进一步探讨。

2.1.4　培养基中的血清固体微载体对培养基,尤其是血清的吸收,引起血清蛋白与细胞对微珠表面竞争吸附,即血清在细胞贴壁时的存在会影响接种过程,使细胞对微珠贴壁率下降,促使细胞凝集。

采用血清补料可解决这一问题[6]。

2.1.5　pH值于培养基的pH影响着微珠表面的电荷密度,综合前文可知较低pH利于细胞贴壁。

研究也表明细胞贴壁的最优pH较其生长时的最优pH低很多,因此微载体上培养细胞总要求从接种到培养阶段的pH程序上升[6,12]。

2.1.6　氧微生物相较,动物细胞在培养中对氧的要求已大为下降,但仍需供给充足的氧以满足细胞在微珠表面生长和扩展的需要。

由于贴壁主要是物理过程,有些细胞（如HepG）对氧几乎无要求,而另一些细胞的贴壁则受供氧情况的影响,甚至必需氧（如肝细胞）。

研究表明氧与细胞的固有性质无关,因此贴壁时氧分压的提高可促进细胞与微珠表面的相互作用或修复细胞曾受的破坏的同时,不影响细胞[10]。

此外,液体深度、微载体浓度、细胞浓度、搅拌间隔等参数对细胞表面的氧分压均有影响,从而影响贴壁。

已建立了以上参数对细胞表面氧分压影响的模型。

影响细胞贴壁的参数还有很多,且它们之间是相互联系的:

如贴壁时细胞与微珠间的相互作用会引起两相界面张力、贴壁微环境中pH值等的变化;接种效率与微载体利用率相互制约,不可同时达到最优等。

此外由于细胞贴壁时的官能度和生存力等随时间下降,因此要求降低贴壁过程总需时,加速细胞贴壁。

2.2　新的细胞培养生长监测法

已有文献[9]归纳常用于微载体培养细胞过程中细胞生长监测的各种方法,这里仅介绍定量影像分析法[13]。

该法需配备扫描电子显微镜,样品须经无Cu2+或Mg2+的PBS洗涤沉降,低温固定,梯度甲醇PPBS程序脱水,真空喷金等预处理。

样品处理后在扫描电子显微镜观察分析。

该法主要用于研究微载体的移植、微载体团聚的形成、培养后期细胞形态大小的变化等。

主要缺点:

二维的影像不能准确表达细胞和微载体三维的情况;个体细胞的孤立分析不符合细胞间相互联系的实际;样品经脱水使测得细胞或微载体团聚的大小小于实际;设备昂贵,处理分析过程复杂而费时。

但定量影像分析不依赖细胞形状,可同时获得微组织的数量、大小、形态等生物质数据,且是目前可得到全部生物质准确定量数据的唯一方法,其应用正越来越广泛。

2.3　培养放大过程的再接种工艺

人用病毒疫苗等物质的需求越来越大,且其生产要求生产菌株在感染、分泌前有一定的浓度和数量,因此要求深入研究微载体培养放大过程,发展再接种工艺。

初期的微载体技术的培养放大须经过培养细胞的剥落、分离和已分离细胞作为放大培养菌种的再接种三步。

细胞剥脱时常破坏了大量细胞,阻碍了大规模生产中微载体的应用。

使用液体微载体或选用球转球放大工艺可解决这一问题。

前文已介绍了液体微载体;球转球放大工艺是直接加入新的微载体,调节培养条件,通过微珠间的接触碰撞实现细胞在微珠间的转移,延长细胞寿命,提高细胞分泌物的产量。

这一工艺条件已初步定量,并建立了动力学模型[4]。

球转球放大工艺虽然操作步骤简单、污染机会少、细胞活性高、微载体损失少而可连续使用,但受细胞运动性的限制使该放大工艺仅在实心微载体上较易实现,制约了在大孔微载体上的应用。

另一个问题是在微载体上进行细胞连续传代时,每一次微珠间的细胞传递均表现细胞增殖能力的下降,但在T瓶进行相同规模的培养时却不出现这种现象。

Sean[14]发现以Cytodex21连续继代培养MRC25细胞系统中每代细胞增殖能力下降的加速缘于培养基中高浓度的血清。

他进而发展了PPRF92培养基补加混合物。

在MRC25细胞连续继代培养时加入PPRF92可保持细胞生长能力;培养基血清水平低至1%时仍能使细胞生长良好;使用补加PPRF92和1%ABS的DMEMPF12培养基可使MRC25在微珠上