戊四氮诱导发育鼠癫痫持续状态后海马内 神经发生与突触重塑的研究.docx
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戊四氮诱导发育鼠癫痫持续状态后海马内神经发生与突触重塑的研究
单位代码：
10313
学号：
100001中图分类号：
R742.1
硕士学位论文
戊四氮诱导发育鼠癫痫持续状态后海马内
神经发生与突触重塑的研究
届别：
二○一三届
专业：
学位类型：
科学学位或专业学位
研究方向：
研究生姓名：
导师姓名：
起止日期：
2011年4月至2013年4月
2013年6月
研究生个人简介
目录
缩略词表1
中文摘要2
Abstract3
前言4
材料和方法5
1材料5
2方法5
结果6
讨论7
结论8
参考文献9
综述10
攻读硕士学位期间发表学术论文11
临床培训小结12
致谢13
论文独创性声明14
论文使用授权声明14
论文审阅认定书15
缩略词表
Abbreviation
缩略词
英文全称
中文全称
BrdU
5-bromo-2’-deoxyuridine
5-溴脱氧尿核苷
BDNF
Brain-derivedneurotrophicfactor
脑源性神经营养因子
COD
Correctedopiticaldensity
校正吸光度
CNS
Centralnervoussystem
中枢神经系统
DAB
Diaminobenzidine
3,3-二氨基联苯胺
DG
Dentategyrus
齿状回
GCL
Granulecelllayer
颗粒细胞层
GFAP
Glialfibrillaryacidicprotein
胶质原纤维酸性蛋白
i.p.
Introperitioneal
腹腔内注射
IGF-I
Insulin-likegrowthfactor-I
胰岛素样生长因子
KA
Kainicacid
红藻氨酸（海人酸）
LTP
Long-termpotentiation
长时程增强
MK-801
5-methyl-10,11-dihydro
5-甲基二氢二苯并环
-5H-dibenzocyclohepten-
庚烯亚胺马来酸
戊四氮诱导发育鼠癫痫持续状态后海马内
神经发生和突触重塑的研究
中文摘要
目的目前，对癫痫反复发作的病因的说法很多，但齿状回颗粒细胞的神经发生增加，颗粒细胞的苔藓纤维异常发芽及伴随的突触重塑已被认为是其细胞机制之一。
故近年有关神经发生和突触重塑的研究正成为脑科学中令人瞩目的热点，但是这些现象对临床上常见的儿童癫痫反复发作的病因是否有作用，目前还少有报道。
方法腹腔注射戊四氮制作发育期SD大鼠（7天、14天、21天和28天四个日龄组）癫痫持续状态（SE）发作模型，再将各日龄组随机分为NS组、SE组和MK-801组，选择处理后第7天、14天和28天三个时间点进行观察。
结果BrdU免疫反应产物：
SE发作后第7天和14天，SE组中各日龄组幼鼠齿状回BrdU阳性细胞数明显高于各自的NS组（P＜0.01），而MK-801组较SE组明显减少（P＜0.05），但在第28天三组之间无明显差异（P＞0.05）；发作后第7天，三组中大部分BrdU阳性细胞分布于颗粒下层。
结论1.癫痫持续状态发作可使不同日龄的发育鼠脑内齿状回神经元发生数量的增加、位置的迁移和异位以及突触的重塑。
2.NMDA受体在癫痫后的神经元发生和突触重塑中起着促进作用。
关键词发育鼠；癫痫持续状态；突触素；海马；BrdU；MK-801
Thestudyofneurogenesisandsynapticplasticityinhippocampusfollowingpentylenetetrazol-inducedstatusepilepticusofdevelopingrats
Abstract
ObjectiveRecentlydentategranulecellneurogenesisinhippocampusand
mossyfiberabnormalsproutingandsynapticreorganizationhavebeenidentifiedasoneofcellmechanismofrecurrentattacksofepilepsy.Thustheresearchofneurogenesisandsynapticreorganizationhasbeenoneofhotspotsinadultbrainstudy.Buttherewaslittledataofepilepsymechanismonchildrenwithrecurrentepilepsyfrequentlyinclinic.
MethodsPostnatalday（P）P7,P14,P21andP28SpragueDawley（SD）ratswerereceivedPTZtomakestatusepilepticusmodels,whichweredividedrandomlyintoSEgroup,wesubjectedMK-801toratsafterPTZandobservedthechangesofthemabove.
Results1.BrdUimmunohischemistry:
QuantitativeanalysisofBrdUlabelingrevealedasignificantincreaseintheproliferationrateofneuralprecursorcellsinthedentategyrus7daysand14daysafterSE.Buton28daysafterSEtherewasnodifferenceamongthreegroups（P＞0.05）.
ConclusionSEmayinducetheneurogenesisandsynapticplasticityinhippoca-
mpusindevelopingbrain.Intheprocessofneurogenesis,thereisanincreaseinnumberandmigrationinlocation.AndNMDAreceptorplaysanimportantroleintheneurogenesisofhippocampusandsynapticplasticityafterseizures.
Keywordsdevelopingrats;statusepilepticus;neurogenesis;synaptophysin;
hippocampus;MK-801
前言
癫痫（Epilepsy）是最常见的神经系统疾病之一，是由于脑细胞突然异常放电所引起的反复性惊厥发作。
近年来由于环境和心理因素癫痫的发病率有逐年增高的趋势，据统计我国每年新发癫痫在40万例左右，其中高发区每年每十万人口新发病例60例左右，而儿童癫痫发病率比成人高出1～4倍，尤以出生后1岁内发病率最高[1]。
因此对儿童癫痫的发病机制和治疗的研究越来越受到重视，但对于癫痫机制研究的思路和设想目前大多来源于对癫痫病灶的病理和生化活动的详细观察。
由于癫痫病灶最常见的病理变化（以海马区为例）是神经元变性、凋亡和坏死，未死亡神经元树突分布范围的缩小和突触棘的消失，胶质细胞的增生以及海马颗粒细胞的轴突发芽等。
因此，大多数癫痫的机制假说均以此为依据。
目前，对癫痫反复发作的病因的说法很多，但齿状回颗粒细胞的神经发生增加、颗粒细胞的苔藓纤维异常发芽及伴随的突触重塑已被认为是其可能的细胞机制之一。
过去研究认为，哺乳类中枢神经系统的神经发生主要限于胚胎期，而且认为出生后将不再存在神经发生现象。
但近来研究发现，脊椎动物中枢神经系统很多区域包括海马齿状回在生后乃至成年的整个发育期仍然保持着神经发生的能力，并在某些生理刺激和病理因素作用下，这些部位的神经发生表现出明显的增强趋势[2,3]，从而使人们对神经元再生的认识产生了根本性改变，并揭开了中枢神经系统神经再生在不同病理状态下如何发挥作用的新研究。
另外，神经系统受损后现存的神经元可通过轴突出芽形成不同的径路与原有的突触后位点或新的突触后位点发生接触,形成新的突触；同时，平时处于休眠状态的侧支和突触联系在病理状态下被激活，从而完成神经回路的改造和突触的重塑。
材料和方法
1材料
1.1试剂
戊四氮Sigma公司
BrdUSigma公司
抗体稀释液北京中山生物技术有限公司
Triton-x100华美生物工程公司
1.2仪器
FA1004型电子天平上海天平仪器厂
OlymphusPM-CB日本奥林巴斯公司
KD1508轮转式切片机浙江金华科迪设备有限公司
S2-93自动双重纯水蒸馏器上海亚莱生化仪器厂
各种微量加样仪芬兰Labsystem公司
2方法
2.1研究对象选择健康SpragueDawley（SD）大鼠出生后第7天、14天、21天和28天（Postnatal,P7,P14,P21,P28）四个日龄组，雌雄不限，同一日龄组内体重相近，各组均为54只，共计216只，由**医学院实验动物中心提供。
将大鼠再随机分为癫痫持续状态组（SE组）、MK-801治疗组（MK-801组）和正常对照组（NS组），每组各6只。
结果
1动物模型行为表现
SE组和MK-801组：
注射PTZ后经过1～2分钟的潜伏期，大鼠由自由活动状态逐渐转为安静或俯卧，随后出现眼神呆滞，头面部肌肉轻微抽搐，伴有须动、耳抖和搔抓动作，继而进入大发作期，渐次出现前肢阵挛、狂奔、跳跃、嘶叫、后肢站立伴头偏向一侧及全身阵发性抽动；达到7级发作的动物则表现为摔倒、翻滚等全身强直-阵挛性发作，同时伴有喉鸣、口角流涎、肢端青紫等。
整个发作持续为1小时后经注射安定后逐渐缓解，发作停止后，动物可自由活动。
NS组：
注射NS后无任何发作迹象和抽搐表现，行为正常。
2BrdU免疫反应产物
SE发作后第7天和14天，SE组各日龄组幼鼠齿状回BrdU阳性细胞数明显高于各自的NS组，同时MK-801组较SE组明显减少（P＜0.05），但在第28天时三组之间无明显差异（P＞0.05）（见表1和图2～5）。
SE发作后第7天，三组幼鼠的大部分BrdU阳性细胞分布于颗粒下层（见图1A），发作后第14天，新生细胞在SE组和MK-801组幼鼠中除主要分布于颗粒细胞层以外，另有一部分位于门区和内分子层（图1B），而在NS组幼鼠的BrdU阳性细胞主要分布于整个颗粒细胞层（见图1C）。
新生细胞在由颗粒下层向颗粒细胞层迁移的过程中，胞核变大，形状更接近圆形或卵圆形（见图1D）。
阴性对照试验切片无特征性免疫反应产物。
讨论
本实验中对发育鼠年龄的选择是基于人脑和大鼠脑发育程度的对应关系。
虽然大鼠脑发育与人脑发育的年龄对应关系目前还不十分清楚，但普遍接受的观点认为，生后5～7d大鼠的脑发育程度与足月新生儿的脑发育程度相当，15d大鼠的脑发育程度与1岁儿童相当，28～30d大鼠的脑发育程度与2岁儿童相当[6]，大鼠于生后50d左右进入青春期，生后60d性成熟。
由于儿童癫痫发病率比成人高，以出生后2岁内发病率最高，因此本试验中选择发育鼠的年龄段与人类癫痫的好发年龄相当，能够很好地反映出癫痫发作对发育期大鼠的脑损伤结果。
本实验中采用BrdU来标记新生细胞是源于以下理论：
细胞增殖周期包括G1、S、G2和M期4个时期，S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。
故BrdU标记和检测的准确性高，而且方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖的理想指标[7~8]，目前已被越来越多地用于神经发生的研究领域。
一、癫痫发作后的齿状回神经发生
人和大多数哺乳动物的部分脑区产生新神经元的过程称之神经发生[9]，主要存在于海马齿状回及侧脑室下带（subventricularzone,SVZ）等脑区，最近研究表明在动物的一生中，这些地方不断地进行着干细胞和祖细胞的分裂并生成新神经元。
DG各区均有不同程度的颗粒细胞前体增殖，新生神经元发育产生轴、树突并建立突触联系，而这一过程极易受个体所处的外界环境和病理因素的影响，使得海马区结构具有极大的适应性和可塑性。
结论
本实验条件下
1．SFI可以改善HIBD新生大鼠的生长发育，提高其生存率。
2．SFI减少HIBD新生大鼠海马神经元凋亡的发生。
3．SFI能增强HIBD新生大鼠海马CA1区锥体细胞Bcl-2的蛋白表达，减弱Bax蛋白的表达。
参考文献
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缺氧缺血性脑损伤细胞凋亡的
机制及治疗进展
综述
新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemicbraindamage,HIBD）系新生儿窒息后严重并发症,是导致新生儿死亡及影响神经预后的严重疾病。
该病病情重,病死率高,并可能产生永久性神经功能障碍,如智力低下、癫痫、脑性瘫痪、痉挛和共济失调等。
因此及时诊断和采用有效的治疗手段对提高存活率减少后遗症有重要意义。
对于新生儿HIBD的发病机制和防治方法的研究,由于受到临床多方面条件的制约,很多资料难以获得,因此目前多采用HIBD动物模型进行实验研究。
不同种类动物出生时,脑发育并不处于同一阶段,人脑发育的高峰期即脑占体重的百分比最大的时候在出生时,这与7日龄新生大鼠的脑处于同一发育阶段[1],现就以新生大鼠为模型对HIBD细胞凋亡的机制及其治疗进展作一综述。
1凋亡的概念
细胞凋亡是个体发育过程中基因调控下的细胞自杀活动,是机体为调控机体发育、维持内环境稳定,由基因编码程序的细胞主动死亡过程[2-4]。
细胞首先接受、识别某些特殊的生理或病理性刺激信号,然后启动细胞特有的基因或基因群,通过mRNA转录,合成一组致死性效应蛋白质,从而导致细胞解体、死亡,是机体对外界刺激进行主动应答过程。
攻读硕士学位期间发表学术论文
1．戊四氮诱导发育鼠癫痫持续状态后海马突触素的变化及MK-801的影响.徐州医学院学报,2006,26
（2）:
120-124.
2．戊四氮诱导发育鼠癫痫持续状态后海马神经发生及MK-801的影响（中国当代儿科杂志，已修回）
3．24h动态脑电图监测对癫痫的诊断与鉴别诊断的价值（徐州医学院学报，审稿中）
临床培训小结
本人于20**年9月考取徐州医学院研究生攻读儿科学硕士学位。
三年来，在院、研究生学院、导师、科室老师以及附院各级领导的关怀之下，通过研究生阶段三年的基础理论学习、严格的科研训练和正规的临床培训，使自己的基础理论、科研能力和临床医疗水平、为人等方面较入学前有了显著的提高。
一、临床培训时间按排
徐州医学院附属医院儿科，临床培训18个月
20**年3月～
二、培训内容
1、临床专业理论学习
临床培训期间，在导师的指导下对儿科及相关专业理论知识进行了系统全面的学习，通过了专业课和专业英语的考核。
对儿科常见病、多见病、疑难病的病因、病理机制、鉴别诊断及诊断治疗有了更加系统全面的认识。
2、临床技能学习与实践
三、临床能力评估
通过严格的临床培训，目前可独立完成儿科常见操作，完成儿科常见急症的诊断、治疗及紧急处理；对本专业相关辅助检查结果可以做出较准确的诊断。
可以协助老师完成本专业的高难度手术。
四、总结
通过临床培训，不仅使我的儿科专业技能得到了很大的提高，更开阔了思维，增长了知识，为毕业后更好的从事临床儿科工作打下了坚实的基础！
致谢
论文独创性声明
本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。
其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。
作者签名：
日期：
201年月
论文使用授权声明
本人完全了解徐州医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：
学校有权保留送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。
保密的论文在解密后遵守此规定。
作者签名：
导师签名：
日期：
201年月
论文审阅认定书
研究生在规定的学习年限内，按照研究生培养方案的要求，完成了研究生课程的学习，成绩合格；在我的指导下完成本学位论文，经审阅，论文中的观点、数据、表述和结构为我所认同，论文撰写格式符合学校的相关规定，同意将本论文作为学位申请论文送专家评审。
导师签名：
日期：
201年月
升级会员 