楮实提取物体外抗氧化活性的研究.docx
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楮实提取物体外抗氧化活性的研究
楮实提取物体外抗氧化活性的研究
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作者：
吴兰芳张振东景永帅杨娟【摘要】目的探讨楮实提取物的体外抗氧化活性。
方法先用80%乙醇，然后用蒸馏水对楮实进行提取。
其中醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，水提部分经醇沉、干燥后得到楮实粗多糖。
运用羟基（·OH）自由基体系、二苯代苦味基肼（DPPH·）自由基体系和对Fe3+的还原能力实验，比较楮实各提取物的抗氧化活性。
结果楮实提取物对·OH自由基和DPPH·自由基均有较好的清除作用，其中总醇提取物对·OH自由基的清除能力最强，其IC50值为0.28mg/ml；乙酸乙酯提取物对DPPH·自由基的清除效果最好，其IC50值达到0.08mg/ml；各提取物对Fe3+均有较强的还原能力，乙酸乙酯提取物还原效果最为明显。
结论楮实提取物具有一定的抗氧化活性，在抗衰老方面有广泛的应用前景。
【关键词】楮实；抗氧化活性；清除自由基；还原力【Abstract】ObjectiveTostudytheantioxidantactivitiesofextractsfromBroussonetiapapyriferainvitro.MethodsB.papyriferawastreatedwith80%ethanolandthentheresiduewasextractedwithwater.Theethanolextractwereextractedrespectivelybypetroleumether,chloroform,ethylacetate,nbutanol.Atthesametime,crudepolysaccharidewasobtainedbyethanolprecipitationfromwaterextract.Theantioxidantactivitiesoftheaboveextractsinvitrowerecomparedbythehydroxylfreeradical（·OH）,DPPHfreeradical（DPPH·）anddeoxidizationFe3+reactionsystem.ResultsTheextractsfromB.papyriferahadgoodscavengingeffectonthehydroxylfreeradicalandDPPHfreeradical.Ethanolextracthadthebestscavengingeffectonhydroxylfreeradicalsystem,whichcorrespondingIC50valuewas0.28mg/ml.EthylacetateextactshadthebestscavengingeffectonDPPHfreeradical,whichcorrespondingIC50valuereachedto0.08mg/ml.AlloftheextractshadstrongdeoxidizationabilityofFe3+.Amongofthem,ethylacetateextractshadsignificantdeoxidizationability.ConclusionsBroussonetiapapyriferahasstrongerantioxidantactivitiesandwillbewidelyapplicatedonantiaging.【Keywords】Broussonetiapapyrifera;Antioxidantactivity;Radicalscavenging;Deoxidization 楮实子具有活血理气、补肾清肝、明目、利尿的功效，多用于腰膝酸软、虚劳骨蒸、头晕目眩、目生翳膜、水肿胀满等症〔1，2〕。
一些含楮实子的经典方药经多年临床验证具有确切的抗衰老、促智作用〔3〕。
机体内氧化自由基增加是导致衰老的主要原因，清除自由基可起到延年益寿的作用〔4〕。
近年来研究发现楮实子油及楮实子黄酮成分有显著的抗氧化和清除及抑制氧自由基作用〔5〕；楮实子红色素能显著清除超氧阴离子及羟基（·OH）自由基，抑制H2O2诱导小鼠红细胞溶血和肝匀浆自氧化，对肝线粒体也有保护作用〔6〕。
但目前还未见到对楮实聚花果进行抗氧化活性评价的报道。
本实验运用水杨酸法、二苯代苦味基肼自由基（DPPH·）法、Fe3+还原能力的方法对楮实不同极性溶剂提取物体外抗氧化能力进行评价，为楮实更广泛地应用于医药和开发新型保健品提供理论依据。
1材料与方法 1.1材料与试剂 药材于2009年7月采自贵州省贵阳市药用植物园，经贵阳中医学院孙庆文老师鉴定为构树〔Broussonetiapapyrifera（L.）Vent.〕的成熟果实。
DPPH·（百灵威公司）；抗坏血酸（Vc）、无水乙醇、H2O2、水杨酸、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氟乙酸均为国产分析纯试剂，乙醇为食用级。
1.2仪器与设备 HP8453型紫外可见分光光度计（惠普公司）；JA2003精密电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；DK9811电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.3提取与制备 楮实干燥粉碎，80%乙醇回流提取5次，每次回流2h，乙醇提取液减压浓缩至无醇味，得楮实总醇提物。
取适量醇提物用水混悬后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取液及萃取后的水层部分减压浓缩至固体，真空干燥后得石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水层部分，作为待测样品置于干燥器中保存。
将乙醇浸提后的药材残渣在室温下挥去乙醇，加入蒸馏水，沸水浴提取5次，每次2h。
合并水提液减压浓缩至一定体积，加入乙醇沉淀多糖，乙醇最终浓度≥80%，沉淀真空干燥后即为楮实水提粗多糖，作为待测样品置干燥器中保存备用。
1.4抗氧化活性测定 1.4.1清除·OH自由基〔7〕 采用Fenton反应，利用H2O2与Fe2+混合产生·OH自由基，在该体系中加入水杨酸捕捉·OH自由基并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收。
取各萃取物50mg，用无水乙醇溶解并定容至25ml；取粗多糖50mg用蒸馏水溶解，定容至25ml，配制得2mg/ml的各样品质量浓度，再以该质量浓度配制成所需浓度。
依次加入样品4ml，9mmol/LFeSO40.5ml，9mmol/L水杨酸0.5ml，8.8mmol/LH2O20.5ml。
该体系于37℃水浴中加热30min，于510nm处测定样品吸光度（Ai）。
用4ml蒸馏水代替体系中的样品，测定得空白吸光度（A0）。
向体系中加入蒸馏水0.5ml代替8.8mmol/LH2O2，测定样品本底吸光度（Aj）。
每个质量浓度样品做3个平行，取其平均值，以Vc作阳性对照，按下式计算清除率：
K（%）=〔A0-（Ai-Aj）〕/A0×100。
1.4.2清除DPPH·自由基〔8〕 DPPH·自由基是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517nm波长有较大吸收，当加入抗氧化剂一部分自由基被清除，使得在该波长下吸收减弱，可借此来评价物质的抗氧化活性。
取各萃取物50mg，用无水乙醇溶解并定容至25ml；取粗多糖50mg，用蒸馏水溶解并定容至25ml，配制得2mg/ml的各样品质量浓度，再以该质量浓度配制成所需浓度；以无水乙醇配制0.16mmol/LDPPH·溶液，避光保存。
取3ml待测样品溶液加入3mlDPPH·溶液于25℃水浴中加热15min，在517nm测得试样吸光度（Ai）。
取3ml蒸馏水代替样品测得空白吸光度（A0）。
向3ml样品中加入3ml蒸馏水测得样品本底吸光度（Aj），每个质量浓度样品做3个平行，取平均值。
以Vc作阳性对照，按下式计算清除率：
K（%）=〔A0-（Ai-Aj）〕/A0×100。
1.4.3Fe3+还原能力测定〔9〕 取2.5ml不同质量浓度的样品乙醇溶液，加入0.2mol/L磷酸缓冲液2.5ml及1%铁氰化钾2.5ml，50℃水浴反应20min后急速冷却，加入10%三氟乙酸溶液2.5ml混匀，4000r/min离心10min，取上清液5ml，加入4ml蒸馏水及0.1%FeCl31ml，10min后于700nm处测定吸光值。
以Vc作为阳性对照。
2结果 2.1对·OH自由基的清除作用 由图1可以看出，大部分提取物对·OH自由基都表现出一定程度的清除能力，并在实验浓度范围内呈明显的量效关系，但各部分提取物的清除能力都弱于Vc。
清除能力大小依次为总醇提取物＞氯仿提取物＞正丁醇提取物＞粗多糖＞水层＞乙酸乙酯提取物。
考虑到样品本底吸收的影响，本实验样品最高浓度为1mg/ml，未测定更高浓度样品的清除作用。
石油醚提取部分效果不明显，故未对其进行比较分析。
楮实提取物对·OH自由基清除活性的半清除率浓度（IC50，mg/ml）值顺序为：
Vc（0.06）＜总醇提取物（0.28）＜氯仿提取物（0.31）＜正丁醇提取物（0.41）＜粗多糖（0.74）＜水层部分（1.01）＜乙酸乙酯提取物（12.44）。
半清除率浓度与清除能力大小成负相关，即半清除率浓度越小则清除能力越强，除乙酸乙酯提取物外，醇提物的各提取部分的半清除率浓度随着提取溶剂极性增大而增大。
2.2对DPPH·自由基的清除作用 DPPH·自由基属于比较稳定的有机物自由基，广泛应用于测定纯抗氧化剂或植物提取物的体外抗氧化活性。
以抗氧化剂Vc作为参照，本研究利用该法对比了提取物的DPPH·自由基清除效果。
从图2可看出，各个部分对DPPH·自由基都表现出较强的清除能力，并在实验浓度范围内呈明显量效关系，但各部分的清除能力都低于Vc，乙酸乙酯对DPPH·自由基的清除能力最好。
由于样品本身吸收的影响较大而未对更高质量浓度进行实验。
清除能力大小依次为Vc＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞水层部分＞正丁醇提取物＞石油醚提取物＞总醇提取物＞粗多糖。
对DPPH·自由基清除作用的半清除率浓度（IC50，mg/ml）大小依次为Vc（0.01）＜乙酸乙酯提取物（0.08）＜氯仿提取物（0.09）＜水层部分（0.20）＜正丁醇提取物（0.32）＜石油醚提取物（0.34）＜总醇提取物（0.54）＜粗多糖（0.77）。
乙酸乙酯提取物的效果较好，但与Vc仍存在较大差距。
2.3对Fe3+还原能力的测定 还原能力的测定，可检验化合物是否为良好的电子供应体，它所提供的电子可以使Fe3+还原为Fe2+，从而使体系溶液颜色改变，即反映出体系中氧化还原状态的改变。
吸光值越大，还原力越强，抗氧化效果愈佳。
由图3可看出，各提取物的还原能力与其质量浓度都成正的量效关系，在浓度为0.6mg/ml时，各部分的还原能力大小依次为Vc＞乙酸乙酯提取物＞水层部分＞氯仿提取物＞总醇提取物＞粗多糖＞正丁醇提取物＞石油醚提取物。
3讨论楮实多指桑科植物构树〔Broussonetiapapyrifera（L.）Vent.〕的球形聚花果，肉质，熟时为橙红色，味酸甜，可食用。
而通常所说的中药楮实子应为楮实聚花果内的小瘦果〔10〕。
构树的树叶、果实、根、乳汁均有很高的药用价值，近几年部分省份开始对构树进行产业化开发〔11〕，如湖北省发展800万亩，贵州省种植100万亩构树林，广西种植200亩。
若按每亩构树年产鲜果800kg〔12〕计算，仅贵州省年产楮实可达80万吨，资源非常丰富，具有很好的开发利用前景。
随着增龄，机体抗氧化系统的抗氧化能力下降，自由基代谢产物增加。
自由基在细胞内可发生多位点损伤，这些损伤的积累会促使机体老化和引发诸如老年痴呆、帕金森病、癌症、高脂血症、糖尿病等相关疾病〔13，14〕。
因而降低自由基代谢产物的生成，是延缓衰老的重要途径。
本实验通过3种评价方法对楮实的体外抗氧化活性进行考察，结果表明楮实具有清除自由基、增加Fe3+还原的能力，具有很好的体外抗氧化活性。
这与楮实具有抗或延缓老年性痴呆的作用是一致的〔15〕。
楮实在预防机体衰老和抗衰老的应用方面应得到充分的重视。
【参考文献】 1LeeD，BhatkPL,FongHH,etal.AromataseinhibitorsfroBroussonetiapapyrifera〔J〕.JNatProd，2001；64:
128693. 2熊山，叶祖光.楮实子化学成分及药理作用研究进展〔J〕.中国中医药信息杂志,2009；16（5）:
1023. 3黄宝康，秦路平，郑汉臣，等.楮实子的临床应用研究〔J〕.时珍国医国药，2002；13（7）：
4345. 4张洪泉.抗衰老药理学新论〔M〕.北京：
人民卫生出版社，2004:
67. 5袁晓,袁萍.楮实子油及楮实子黄酮成分的抗氧化清除自由基作用的研究〔J〕.天然产物研究与开发，2005；17:
236. 6庞素秋，王国权，秦路平，等.楮实子红色素体外抗氧化作用研究〔J〕.中药材，2006；3（3）:
2625. 7刘春兰，刘海青，邓义红等.沙棘叶水溶性多糖的分离纯化及体外清除自由基活性研究〔J〕.中药材，2006
（2）:
1514. 8高春燕，田呈瑞,周默.枸杞多糖体外清除自由基活性研究〔J〕.三峡大学学报（自然科学版），2005；（5）:
4568. 9刘朝霞，胡士德,邹坤，等.资木瓜乙醇提取物的体外抗氧化活性研究〔J〕.三峡大学学报（自然科学版），2008；30（4）:
725. 10魏会琴，刘忠华,万文.构树研究概况及展望〔J〕.福建林业科技，2008；12（4）：
2614. 11张秋玉，李远发,梁芳.构树资源研究利用现状及其展望〔J〕.广西农业科学，2009；40
（2）:
21720. 12李华西.构树：
具有较高发展价值的乡土树种〔J〕.中国林业产业，2007；1:
356. 13张建平,易醒，肖小年.泽泻提取物自由基清除能力的研究〔J〕.时珍国医国药,2009；20
（2）:
11812. 14吴海燕，杨云霞.氧化应激与老年痴呆症的发生发展关系〔J〕.四川生理科学杂志，2007；3:
1246. 15赵字军，胡支农，戴新民.中药楮实的本草记载和现代研究进展〔J〕.解放军药学学报，2000；16（4）:
197200.
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