楮实提取物体外抗氧化活性的研究.docx

1、楮实提取物体外抗氧化活性的研究楮实提取物体外抗氧化活性的研究（作者:_单位: _邮编: _） 作者：吴兰芳 张振东 景永帅 杨娟【摘要】 目的 探讨楮实提取物的体外抗氧化活性。方法 先用80%乙醇，然后用蒸馏水对楮实进行提取。其中醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，水提部分经醇沉、干燥后得到楮实粗多糖。运用羟基（OH）自由基体系、二苯代苦味基肼（DPPH）自由基体系和对Fe3+的还原能力实验，比较楮实各提取物的抗氧化活性。结果 楮实提取物对OH自由基和DPPH自由基均有较好的清除作用，其中总醇提取物对OH自由基的清除能力最强，其IC50值为0.28 mg/ml；乙酸乙酯提取物对D

2、PPH自由基的清除效果最好，其IC50值达到0.08 mg/ml；各提取物对Fe3+均有较强的还原能力，乙酸乙酯提取物还原效果最为明显。结论 楮实提取物具有一定的抗氧化活性，在抗衰老方面有广泛的应用前景。 【关键词】 楮实；抗氧化活性；清除自由基；还原力 【Abstract】 Objective To study the antioxidant activities of extracts from Broussonetia papyrifera in vitro. Methods B. papyrifera was treated with 80% ethanol and then the

3、residue was extracted with water. The ethanol extract were extracted respectively by petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, n butanol. At the same time, crude polysaccharide was obtained by ethanol precipitation from water extract. The antioxidant activities of the above extracts in vitro were

4、compared by the hydroxyl free radical (OH), DPPH free radical (DPPH) and deoxidization Fe3+ reaction system. Results The extracts from B. papyrifera had good scavenging effect on the hydroxyl free radical and DPPH free radical. Ethanol extract had the best scavenging effect on hydroxyl free radical

5、system, which corresponding IC50 value was 0.28 mg/ml. Ethyl acetate extacts had the best scavenging effect on DPPH free radical, which corresponding IC50 value reached to 0.08 mg/ml. All of the extracts had strong deoxidization ability of Fe3+. Among of them, ethyl acetate extracts had significant

6、deoxidization ability. Conclusions Broussonetia papyrifera has stronger antioxidant activities and will be widely applicated on anti aging. 【Key words】 Broussonetia papyrifera; Antioxidant activity; Radical scavenging; Deoxidization楮实子具有活血理气、补肾清肝、明目、利尿的功效，多用于腰膝酸软、虚劳骨蒸、头晕目眩、目生翳膜、水肿胀满等症1，2。一些含楮实子的经典方药

7、经多年临床验证具有确切的抗衰老、促智作用3。机体内氧化自由基增加是导致衰老的主要原因，清除自由基可起到延年益寿的作用4。近年来研究发现楮实子油及楮实子黄酮成分有显著的抗氧化和清除及抑制氧自由基作用5；楮实子红色素能显著清除超氧阴离子及羟基(OH)自由基，抑制H2O2诱导小鼠红细胞溶血和肝匀浆自氧化，对肝线粒体也有保护作用6。但目前还未见到对楮实聚花果进行抗氧化活性评价的报道。本实验运用水杨酸法、二苯代苦味基肼自由基(DPPH)法、Fe3+还原能力的方法对楮实不同极性溶剂提取物体外抗氧化能力进行评价，为楮实更广泛地应用于医药和开发新型保健品提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂药材于20

8、09年7月采自贵州省贵阳市药用植物园，经贵阳中医学院孙庆文老师鉴定为构树Broussonetia papyrifera(L.)Vent.的成熟果实。DPPH(百灵威公司)；抗坏血酸（Vc）、无水乙醇、H2O2、水杨酸、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氟乙酸均为国产分析纯试剂，乙醇为食用级。1.2 仪器与设备HP 8453型紫外可见分光光度计(惠普公司)；JA2003精密电子天平(上海恒平科学仪器有限公司)；DK 98 11电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。1.3 提取与制备楮实干燥粉碎，80%乙醇回流提取5次，每次回流2 h，乙醇提取液减压浓缩至无醇味，得楮实

9、总醇提物。取适量醇提物用水混悬后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取液及萃取后的水层部分减压浓缩至固体，真空干燥后得石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水层部分，作为待测样品置于干燥器中保存。 将乙醇浸提后的药材残渣在室温下挥去乙醇，加入蒸馏水，沸水浴提取5次，每次2 h。合并水提液减压浓缩至一定体积，加入乙醇沉淀多糖，乙醇最终浓度80%，沉淀真空干燥后即为楮实水提粗多糖，作为待测样品置干燥器中保存备用。1.4 抗氧化活性测定1.4.1 清除OH自由基7采用Fenton反应，利用H2O2与Fe2+混合产生OH自由基，在该体系中加入水杨酸捕捉OH自由基并产生有色物

10、质，该物质在510 nm处有最大吸收。取各萃取物50 mg，用无水乙醇溶解并定容至25 ml；取粗多糖50 mg用蒸馏水溶解，定容至25 ml，配制得2 mg/ml的各样品质量浓度，再以该质量浓度配制成所需浓度。依次加入样品4 ml，9 mmol/L FeSO4 0.5 ml，9 mmol/L水杨酸0.5 ml，8.8 mmol/L H2O2 0.5 ml。该体系于37水浴中加热30 min，于510 nm处测定样品吸光度（Ai）。用4 ml蒸馏水代替体系中的样品，测定得空白吸光度（A0）。向体系中加入蒸馏水0.5 ml代替8.8 mmol/L H2O2，测定样品本底吸光度（Aj）。每个质量浓

11、度样品做3个平行，取其平均值，以Vc作阳性对照，按下式计算清除率：K(%)=A0-(Ai-Aj)/A0100。1.4.2 清除DPPH自由基8DPPH自由基是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517 nm波长有较大吸收，当加入抗氧化剂一部分自由基被清除，使得在该波长下吸收减弱，可借此来评价物质的抗氧化活性。取各萃取物50 mg，用无水乙醇溶解并定容至25 ml；取粗多糖50 mg，用蒸馏水溶解并定容至25 ml，配制得2 mg/ml的各样品质量浓度，再以该质量浓度配制成所需浓度；以无水乙醇配制0.16 mmol/L DPPH溶液，避光保存。取3 ml待测样品溶液加入3 ml DPPH溶液

12、于25水浴中加热15 min，在517 nm测得试样吸光度（Ai）。取3 ml蒸馏水代替样品测得空白吸光度（A0）。向3 ml样品中加入3 ml蒸馏水测得样品本底吸光度（Aj），每个质量浓度样品做3个平行，取平均值。以Vc作阳性对照，按下式计算清除率：K(%)=A0-(Ai-Aj)/A0100。1.4.3 Fe3+还原能力测定9取2.5 ml不同质量浓度的样品乙醇溶液，加入0.2 mol/L磷酸缓冲液2.5 ml及1%铁氰化钾2.5 ml，50水浴反应20 min后急速冷却，加入10%三氟乙酸溶液2.5 ml混匀，4 000 r/min离心10 min，取上清液5 ml，加入4 ml蒸馏水及0

13、.1% FeCl3 1 ml，10 min后于700 nm处测定吸光值。以Vc作为阳性对照。 2 结 果2.1 对OH自由基的清除作用由图1可以看出，大部分提取物对OH自由基都表现出一定程度的清除能力，并在实验浓度范围内呈明显的量效关系，但各部分提取物的清除能力都弱于Vc。清除能力大小依次为总醇提取物氯仿提取物正丁醇提取物粗多糖水层乙酸乙酯提取物。考虑到样品本底吸收的影响，本实验样品最高浓度为1 mg/ml，未测定更高浓度样品的清除作用。石油醚提取部分效果不明显，故未对其进行比较分析。 楮实提取物对OH自由基清除活性的半清除率浓度（IC50，mg/ml）值顺序为：Vc(0.06)总醇提取物(0

14、.28)氯仿提取物(0.31)正丁醇提取物(0.41)粗多糖(0.74)水层部分(1.01)乙酸乙酯提取物（12.44）。半清除率浓度与清除能力大小成负相关，即半清除率浓度越小则清除能力越强，除乙酸乙酯提取物外，醇提物的各提取部分的半清除率浓度随着提取溶剂极性增大而增大。2.2 对DPPH自由基的清除作用DPPH自由基属于比较稳定的有机物自由基，广泛应用于测定纯抗氧化剂或植物提取物的体外抗氧化活性。以抗氧化剂Vc作为参照，本研究利用该法对比了提取物的DPPH自由基清除效果。从图2可看出，各个部分对DPPH自由基都表现出较强的清除能力，并在实验浓度范围内呈明显量效关系，但各部分的清除能力都低于V

15、c，乙酸乙酯对DPPH自由基的清除能力最好。由于样品本身吸收的影响较大而未对更高质量浓度进行实验。清除能力大小依次为Vc乙酸乙酯提取物氯仿提取物水层部分正丁醇提取物石油醚提取物总醇提取物粗多糖。 对DPPH自由基清除作用的半清除率浓度（IC50，mg/ml）大小依次为Vc(0.01)乙酸乙酯提取物(0.08)氯仿提取物(0.09)水层部分(0.20)正丁醇提取物(0.32)石油醚提取物(0.34)总醇提取物(0.54)粗多糖(0.77)。乙酸乙酯提取物的效果较好，但与Vc仍存在较大差距。2.3 对Fe3+还原能力的测定还原能力的测定，可检验化合物是否为良好的电子供应体，它所提供的电子可以使Fe

16、3+还原为Fe2+，从而使体系溶液颜色改变，即反映出体系中氧化还原状态的改变。吸光值越大，还原力越强，抗氧化效果愈佳。由图3可看出，各提取物的还原能力与其质量浓度都成正的量效关系，在浓度为0.6 mg/ml时，各部分的还原能力大小依次为Vc乙酸乙酯提取物水层部分氯仿提取物总醇提取物粗多糖正丁醇提取物石油醚提取物。3 讨 论 楮实多指桑科植物构树Broussonetia papyrifera(L.)Vent.的球形聚花果，肉质，熟时为橙红色，味酸甜，可食用。而通常所说的中药楮实子应为楮实聚花果内的小瘦果10。构树的树叶、果实、根、乳汁均有很高的药用价值，近几年部分省份开始对构树进行产业化开发11

17、，如湖北省发展800万亩，贵州省种植100万亩构树林，广西种植200亩。若按每亩构树年产鲜果800 kg12计算，仅贵州省年产楮实可达80万吨，资源非常丰富，具有很好的开发利用前景。随着增龄，机体抗氧化系统的抗氧化能力下降，自由基代谢产物增加。自由基在细胞内可发生多位点损伤，这些损伤的积累会促使机体老化和引发诸如老年痴呆、帕金森病、癌症、高脂血症、糖尿病等相关疾病13，14。因而降低自由基代谢产物的生成，是延缓衰老的重要途径。本实验通过3种评价方法对楮实的体外抗氧化活性进行考察，结果表明楮实具有清除自由基、增加Fe3+还原的能力，具有很好的体外抗氧化活性。这与楮实具有抗或延缓老年性痴呆的作用是

18、一致的15。楮实在预防机体衰老和抗衰老的应用方面应得到充分的重视。【参考文献】 1 Lee D，Bhatk PL,Fong HH,et al.Aromatase inhibitors fro Broussonetia papyriferaJ.J Nat Prod，2001；64:1286 93. 2 熊 山，叶祖光.楮实子化学成分及药理作用研究进展J.中国中医药信息杂志,2009；16(5):102 3. 3 黄宝康，秦路平，郑汉臣，等.楮实子的临床应用研究J.时珍国医国药，2002；13(7)：434 5. 4 张洪泉.抗衰老药理学新论M.北京：人民卫生出版社，2004:6 7. 5 袁 晓

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