胰蛋白酶或抑制剂分离纯化综合.docx

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胰蛋白酶或抑制剂分离纯化综合

实验胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化

在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。

在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N-端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原分子量约为24000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23400，其等电点为pH10.8。

胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。

pH＜3时，胰蛋白酶易变性。

PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。

胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。

重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。

胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。

实验

（一）胰蛋白酶活性测定

[原理]

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。

此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：

酯键＞酰胺键＞肽键。

因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。

本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginineethylester]作为底物，水解反应如下：

N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。

在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。

胰蛋白酶的BAEE单位定义为：

以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。

本实验方法二采用以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活性。

以酪蛋白为底物，主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。

胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯醋酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。

在一定浓度范围内，酶的水解滤液在波长275nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比。

测定中以标准酪氨酸溶液的光吸收作对照，根据活力单位的定义，确定样品中胰蛋白酶的活性。

活力单位的定义：

在一定条件下，每分钟酶水解滤液光吸收的增值与1μmol酪氨酸在275nm处光吸收值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位（U）。

[试剂和器材]

1、试剂

（1）1.0mmol/LBAEE底物溶液

（2）10mmol/LHCl

（3）0.1mol/L、pH8.0硼酸盐缓冲液

（4）10mg/mＬ酪蛋白溶液

取酪蛋白1g，加13mL0.1mol/LNaOH、蒸馏水40mL，置60℃水浴加热至溶解，放至室温后，加水稀释调pH至8.0并定容至100mL。

（5）5%三氯乙酸溶液

（6）0.2mol/L盐酸溶液

（7）50μg/mL酪蛋白对照溶液

精确称取经105℃干燥至恒重的酪氨酸5mg，用0.2mol/L盐酸定容至100mL。

（8）胰蛋白酶样液

2、器材

（1）恒温水浴

（2）紫外分光光度计

（3）离心机

（4）试管

[方法和步骤]

1、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）测定法：

取2个光程为1cm的带盖石英比色杯，分别加入25℃预热过的2.8mL1.0mmol/LBAEE底物溶液。

向一个比色杯内加入0.2mL10mmol/LHCl，作为空白，在波长253nm下调节仪器零点；向另一个比色杯中加入0.2mL待测酶液，立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读3～4min。

测得的结果要使△A253nm/min控制在0.05～0.100之间为宜。

若偏离此范围则要适当增减酶量。

以时间（t）为横坐标，光吸收值（A253nm）为纵坐标作图，在直线部分任选一个时间间隔与相应的光吸收值变化（△A253nm），按以下公式计算胰蛋白酶的活力单位。

2、酪蛋白为底物测定法

（1）取3支试管，1～3编号。

取试管1，加入1.0mL酶液，加用0.1mol/L、pH8.0硼酸盐缓冲液2.0mL，在水浴保温10min，精确加入40℃预热的10mg/mL酪蛋白溶液5.0mL，混匀，立即置于40℃水浴中，准确反应30min后，加入5.0mL的5%三氯乙酸，迅速摇匀。

取试管2，加入1.0mL酶液，加用0.1mol/L，pH8.0硼酸盐缓冲液2.0mL，在40℃水浴保温10min，精确加入5.0mL5%三氯乙酸，摇匀，在40℃水浴保温30min后，再加10mg/mL酪蛋白溶液5.0mL，混匀。

取试管3，分别加入5.0mL5%三氯乙酸和8.0mL0.1mol/L（pH8.0）硼酸缓冲液，混合。

将上述三试管溶液于3500r/min离心10min，分别取上清液。

以试管3离心上清液作参比，在紫外分光光度计中波长275nm处测定试管1和试管2离心上清液的光吸收值（A275）。

（1）酪氨酸对照液的测定

以0.2mol/L盐酸溶液作参比，在波长275nm处测定酪氨酸对照溶液的光吸收值（AS）。

[结果计算]

式中A——试管1测得的光吸收值；

A0——试管2测得的光吸收值；

AS——酪氨酸对照溶液的光吸收值；

C对照——酪氨酸的浓度（μg/mL）；

M对照——酪氨酸的分子量（181.19）；

V总——反应总体积（mL）；

V样品——加入的样液体积（mL）；

t——反应时间（min）；

n——样品的稀释倍数。

实验

（二）胰蛋白酶的提取

［原理］

在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：

胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。

在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。

需采用合适的方法进一步分离纯化。

从动物胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出来。

经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀。

沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活，三种酶原相互作用过程如下：

也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原，利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通过溶液中Ca2+的环境，使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成有活性的酶）。

激活后的酶溶液再进一步分离纯化。

［试剂和器材］

1、试剂

（1）pH2.5～3.0乙酸化的水溶液

（2）10%（体积分数）乙酸

（3）2mol/L硫酸

（4）固体硫酸铵

（5）无水CaCl2

（6）结晶胰蛋白酶

（7）25%乙醇溶液（含0.015mol/ＬHCl、0.05mol/ＬCaCl2）

（8）95%（体积分数）乙醇

（9）5mol/ＬNaOH

（10）丙酮

2、器材

（1）胰脏

（2）组织捣碎机

（3）离心机

（4）磁力搅拌器

（5）透析袋、20目筛网、纱布、水浴锅

（6）烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃漏斗

（7）布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等

［方法和步骤］

方法一

1、胰蛋白酶原的提取

取新鲜胰脏约150g，剥去结缔组织和脂肪，取净重100g，切成碎块，在组织捣碎机中捣碎，并加入2倍体积预冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液，制成匀浆。

浆液倒入500mL烧杯中，用10%（体积分数）乙酸调节pH在2.5～3.0之间，在5～10℃下提取6h以上，并间隙轻轻搅拌。

用4层纱布过滤，尽量挤出滤液。

组织残渣中再加入0.5倍体积（约50mL左右）预冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h），再用4层纱布过滤。

合并两次滤液，用2.5mol/L硫酸调节滤液pH在2.5～3.0之间，4℃放置4h（pH始终保持在2.5～3.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出。

提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤，收集滤液，量取体积（约200mL左右）。

滤液中加入粉末状固体硫酸铵，使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492g，5℃）。

放置过夜，使胰蛋白酶原完全析出。

次日抽滤，弃滤液，压紧并收集滤饼，即胰蛋白酶原粗品。

2、胰蛋白酶原的激活

将胰蛋白酶原粗品称重（湿重），分次加入10倍体积预冷的蒸馏水（按滤饼重量计算），使滤饼完全溶解（一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重1/4）。

用5mol/LNaOH将溶液调至pH8.0，慢慢地搅拌下加入固体无水CaCl2使溶液的Ca2+终浓度达到0.1mol/L（要减去一部分氯化钙与硫酸铵结合生成硫酸钙的钙离子）。

取出2mL溶液用于测定激活前的蛋白含量及酶活性。

原溶液中加入5mg结晶胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，25℃放置2～4h，或4℃放置12～16h，使胰蛋白酶原活化。

每隔1h取样测定胰蛋白酶活性增长情况，直至酶激活速度变慢或停止增长。

一般比活可达到3500～4000BAEE单位/mg。

留取2mL溶液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。

激活酶溶液用2mol/L硫酸调pH至2.5～3.0，滤纸过滤，滤去硫酸钙沉淀，收集滤液，4℃保存备用。

方法二

称取冷冻猪胰脏100g，在2～5℃下解冻，切成小块，用组织捣碎机中绞碎成胰浆，在5～10℃存放24h以上，使胰酶自身活化。

胰浆中加入25%（质量分数）乙醇溶液250mL（25%乙醇溶液中加0.015mol/LHCl、0.05mol/LCaCl2），捣碎机中捣碎1min。

胰浆倒入500mL烧杯中，间隙搅拌，温度20℃左右，活化5～6h。

每隔1.5h，吸取2mL活化液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。

活化反应结束后，胰浆3500r/min离心20min，将离心后上清液用二层纱布过滤。

滤液置250mL烧杯中，以过滤清液的体积为准，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使溶液硫酸铵饱和度为20%。

放置6h后，3500r/min离心20min，保存上清液待用，取沉淀。

沉淀分别用适量95%乙醇洗涤过滤，再用丙酮洗涤，过滤。

最后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅰ。

在上述离心上清液中，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使上清液溶液达到55%硫酸铵饱和度，放置6h后，3500r/min离心30min，取离心沉淀，分别用适量95%乙醇、丙酮洗涤，过滤后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅱ。

实验（三）胰蛋白酶的纯化

［原理］

胰蛋白酶与另外两种蛋白水解酶：

糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）和弹性蛋白酶同时存在于胰脏中。

由于胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的酶蛋白分子在结构上及其它很多性质上的相似之处，往往在一般的制备过程中很难将它们彼此彻底分开，传统的分离、纯化技术难以达到十分满意的结果，但采用亲和层析技术，大大提高了分离纯化的效果。

鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶的抑制剂，对猪和牛的胰蛋白酶有很强的抑制作用（而对胰凝乳蛋白酶无抑制作用）。

在pH7.6～8.0的范围内，猪或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在鸡卵类粘蛋白上，在pH2.5～3.0的范围内，能从鸡卵类粘蛋白上被洗脱下来。

因此，采用鸡卵类粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，可以从胰蛋白酶粗品直接获得高纯度的胰蛋白酶。

反应的基本原理如下：

图胰蛋白酶亲和层析流程示意图

亲和层析需要选择耐用的，非特异性吸附少的，水不溶性的载体，此载体并可在温和条件下与配基能共价偶联，而又不影响配基原有的生物学特性。

琼脂糖凝胶颗粒，具有机械强度高、通透性好、非特异性吸附少等优点，目前作为亲和层析载体使用最广泛。

琼脂糖作为亲和层析基质使用最广泛。

为了增加琼脂糖的稳定性和提高机械强度，在碱性条件下加入环氧氯丙烷进行交联，并适当加入一些硼氢化钠，以还原除去琼脂糖中某些不利于层析的离子基团（如硫酸基）。

珠状交联琼脂糖，在接上配基之前，需要活化。

活化方法很多，溴化氰活化最常用，但该化合物极毒。

本实验方法一使用染料“对β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA）”与琼脂糖反应生成ABSE-琼脂糖，经重氮化反应后与卵粘蛋白配基偶联，制得胰蛋白酶的亲和吸附剂。

亲和吸附剂制备过程主要反应如下：

实验中方法二采用用环氧氯丙烷活化，再与卵粘蛋白配基偶联的方式。

最后制备亲和层析柱纯化胰蛋白酶。

本实验采用自制珠状交联琼脂糖经活化、偶联制备亲和吸附剂。

［试剂和器材］

１、试剂

（1）琼脂糖

（2）卵粘蛋白

（3）环氧氯丙烷

（4）碳酸钠

（5）对β-硫酸酯乙砜基苯胺

（6）0.1mol/ＬpH9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液

（7）0.1mol/ＬpH7.5Tris-HCl缓冲液

（8）0.2mol/ＬpH2.5甘氨酸缓冲液

（9）1mol/ＬNaOH溶液

（10）1mol/ＬNaOH溶液（含2mg/mLNaBH4）

（11）1mol/ＬHCl溶液

（12）1.5mol/Ｌ碳酸钠溶液

（13）5%（质量分数）NaNO2溶液

（14）1，4-二氧六环

2、器材

（1）沸水浴、恒温水浴

（2）加热搅拌器

（3）离心机

（4）层析柱1.2cm×30cm

（5）烧杯、试管、布氏漏斗、抽滤瓶、三角烧瓶

（6）金属网筛、温度计、pH试纸

[方法和步骤]

一、亲和吸附剂——固相化鸡卵粘蛋白的制备

方法一

1、交联琼脂糖

取100mL烧杯，称取琼脂糖2g，加入蒸馏水30mL，用沸水浴使之溶解，冷却凝固。

将凝固的琼脂糖用20目筛网制成小颗粒。

在小烧杯中称取凝胶颗粒，以小颗粒湿重量每g加入1mL1mol/LNaOH（其内含2ml/mLNaBH4）的比例，将相应量的NaOH溶液加入盛有琼脂糖颗粒的小烧杯中。

小烧杯放入盛有适量水的250mL烧杯中，以水浴方式在加热搅拌器上加热至30℃，搅拌。

按上面所加1mol/LNaOH（其内含2ml/mLNaBH4）量的1/10比例，量取环氧氯丙烷，并分成三份。

在30℃加热搅拌的琼脂糖颗粒中加入第一份环氧氯丙烷后，缓缓搅拌升温至45℃，加入第二份环氧氯丙烷，再缓缓搅拌升温至60℃时，加入第三份环氧氯丙烷。

保持60℃，搅拌反应2h。

趁热抽滤，用近沸的蒸馏水抽滤洗涤凝胶颗粒至中性。

2、对氨基苯磺酰乙基（ABSE）-琼脂糖

取100mL烧杯，称取上面交联琼脂糖（抽干湿重）10g，加入10mL蒸馏水，用1mol/LNaOH调pH13（试纸测定）。

取10mL试管，称入0.8g对β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA），加入5mL蒸馏水，置旋涡震荡器上震荡5min，用1.5mol/LNa2CO3调整溶液pH至6，3000r/min离心15min。

离心上清液倒入盛有交联琼脂糖的烧杯中，按上述水浴方式，置加热搅拌器上60℃水浴搅拌3min后，加入0.25gNa2CO3，60℃搅拌反应45min。

抽滤，沉淀用0.05mol/LNaOH洗涤三次，用蒸馏水洗涤三次，抽干。

3、ABSE-琼脂糖重氮化

将上面抽干的ABSE—琼脂糖凝胶颗粒放入100mL烧杯中，加入10mL蒸馏水。

按上述水浴方式置搅拌器上冰浴搅拌，依次加入4℃预冷的1mol/LHCl10mL和5%NaNO2溶液10mL，冰浴搅拌20min。

抽滤。

用4℃预冷的0.05mol/LHCl迅速抽洗二次。

用4℃预冷的蒸馏水迅速抽洗二次，抽干。

4、固相化鸡卵粘蛋白（偶联）

取100mL烧杯，称取0.3g鸡卵粘蛋白，加入10mL0.1mol/LpH9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，溶解后置冰浴中待用。

将上面重氮化的ABSE-琼脂糖凝胶在迅速抽干后即刻加入预先准备于冰浴中的鸡卵粘蛋白溶液中，冰浴搅拌反应10h。

抽滤。

凝胶用蒸馏水抽洗三次。

抽干后放入100mL烧杯，悬浮于适量的0.1mol/LpH7.5Tris-HCl缓冲液中。

方法二用环氧氯丙烷活化

称取10g琼脂糖凝胶层析介质，用100mL1.0mol/LNaCl溶液抽洗（少量多次），100mL蒸馏水抽洗，抽干后转移到100mL三角瓶中，分别加入蒸馏水7mL、1，4-二氧六环8mL、2mol/LNaOH6.5mL和环氧氯丙烷1.5mL，混匀，在45℃恒温水浴中，振摇活化2h。

停止活化，抽去活化剂，再用100mL蒸馏水洗（少量多次），洗后转移至100mL三角瓶中，准备偶联。

称取约100mg鸡卵黏蛋白，用10mL0.lmol/LpH9.5碳酸钠缓冲液充分溶解（取样稀释10倍测定蛋白质浓度），转移到100mL三角瓶中与活化的琼脂糖凝胶介质混匀。

在40℃恒温水浴中，振摇偶联22h左右，停止偶联。

取一个洗净的抽滤瓶，将巳经偶联好的琼脂糖凝胶层析介质抽滤，收集滤液，测定滤液中剩余的鸡卵黏蛋白的含量。

凝胶用100mL1.0mol/LNaCl溶液抽洗，接着用100mL蒸馏水抽洗，再用20mL亲和层析洗脱液洗涤。

将亲和介质转移到50mL的小烧杯内，加人20mL亲和层析平衡液，浸泡20min，脱气，装柱。

二、亲和层析

1、装柱

层析柱（1.2cm×30cm）用水洗干净，柱的上、下端联接塑料管接上小乳胶管，装上螺旋夹。

将层析柱垂直装好。

打开柱上端口，从柱底下出口管朝柱内注入水，使柱底全部充满水而不留气泡，关闭柱出口。

最终柱内留存有1/4～1/5的水。

从出口处接上一根直径2㎜细塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。

轻轻搅动固定化卵粘蛋白凝胶悬浮溶液，立即沿玻棒倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然沉降，待柱底面上积起约1～2㎝的凝胶床后，打开柱出口水流。

随着柱内水的流出，上面不断加入凝胶液，使形成的凝胶床面上有凝胶连续下降（如果凝胶床面上不再有凝胶颗粒下降，应吸去清液，用搅拌均匀地将凝胶床搅起数厘米高后，再加凝胶悬浮液，不使形成断层面）。

当凝胶沉积到柱的顶端约3㎝处，停止装柱，让柱内水面高于凝胶床界面1㎝左右。

用眼睛观察柱内凝胶是否均匀，不应有气泡。

２、平衡

柱装好后，使层析床稳定15min。

然后用0.1mol/LpH7.5Tris-HCl缓冲液洗柱平衡，流速在0.5mL/min左右，将柱内亲和吸附剂中的游离蛋白洗尽，洗至柱流出液A280值在0.050以下。

3、亲和吸附

将实验

（二）提取保存待用的胰蛋白酶粗酶液或粗制品，留少许用于检测。

粗品用适量0.1mol/LpH7.5Tris-HCl缓冲液溶解，溶解液稀释至80mL，用1mol/LNaOH调整溶液至PH7.5～8.0，滤纸过滤。

取清液上柱，进行亲和吸附，流速0.5mL/min。

4、洗柱

吸附完毕。

用0.1mol/LpH7.5Tris-HCl缓冲液洗柱，开始流速0.5mL/min。

20min后，控制流速0.7mL/min。

直至柱流出液A280值小于0.030。

5、脱附

用0.1mol/LpH2.5甘氨酸缓冲液上柱脱附，流速0.15mL/min。

分部收集，每管收集15min（约2mL/管左右）。

6、检测与收集

紫外吸收法检测蛋白含量：

上面收集的各管脱附液于紫外分光光度计中依次测定A280值。

将初始峰值在0.035以上到峰尾数值在0.070左右的那部分收集管合并，作为胰蛋白酶洗脱含量较集中部分。

进行胰蛋白酶活力测定和蛋白质含量测定。

[结果与计算]

1、画出层析图谱；

2、计算亲和层析前后样品和收集峰的酶比活、纯化倍数、酶活性回收率和蛋白质回收率。

实验（四）胰蛋白酶抑制剂的制备

一、亲和层析纯化卵粘蛋白

[原理]

双功能试剂β-硫酸脂乙砜基苯胺（SESA）活化珠状交联琼脂糖，重氮化后与胰蛋白酶偶联形成亲和吸附剂，来制备卵粘蛋白（一种天然的胰蛋白酶抑制剂）。

可参见实验（三）。

[试剂和器材]

1、试剂

（1）对β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA）

（2）1mol/ＬHCl溶液

（3）1mol/ＬNaOH溶液

（4）碳酸钠

（5）1.5mol/Ｌ碳酸钠溶液

（6）5%（质量分数）NaNO2溶液

（7）10ml/mL胰蛋白酶

（8）0.1mol/ＬpH7.5Tris-HCl缓冲液（内含0.01mol/LCaCl2,0.5mol/LNaCl）

（9）0.01mol/LpH4.8乙酸缓冲液（内含0.2mol/LCaCl2,0.3mol/LNaCl）

（10）0.05mol/ＬpH2.5甘氨酸缓冲液

2、器材

（1）新鲜鸡蛋

（2）沸水浴、恒温水浴

（3）抽滤瓶、布氏漏斗

（4）电磁搅拌器

（5）层析柱

（6）部分收集器

（7）紫外分光光度计

[方法和步骤]

1、亲和吸附剂——固定化胰蛋白酶的制备

（1）对氨基苯磺酰乙基（ABSE）-琼脂糖制备

①滤干的琼脂糖凝胶12g加入10mL蒸馏水以1mol/LNaOH溶液调pH至13。

②SESA0.8g悬于5mL蒸馏水中，搅拌下缓慢用1.5mol/LNa2CO3溶液调pH至6.0，待溶解后离心。

③把上述二者混合放入沸水浴中，待温度达到60℃时，立即加入Na2CO30.25g，继续在沸水浴中维持45min。

④抽滤后用0.5mol/LNaOH溶液洗三次，再用蒸馏水洗三次抽干，即得ABSE-琼脂糖。

（2）ABSE-琼脂糖重氮化

①ABSE-琼脂糖凝胶悬于10mL蒸馏水中，放入冰浴中，搅拌下依次加入预冷的1mol/LHCl10mL和5%NaNO2溶液10mL，冰浴中间歇搅拌20min。

②过滤并用预冷的0.05mol/LHCl洗三次，冷蒸馏水洗三次抽干即为重氮盐衍生物。

（3）胰蛋白酶的偶联

将ABSE-琼脂糖重氮衍生物立即投入10ml/mL胰蛋白酶溶液，立即用1.5mol/LNa2CO3维持PH8.0，冰浴中间歇搅拌1.5h，再以少量1mol/LNaCl溶液洗二次，蒸馏水洗三次即可得固定化胰蛋白酶。

2、亲和层析纯化卵粘蛋白

（1）装柱

将制得的固定化胰蛋白酶悬浮于约一倍体积的0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5）中，按常规装柱。

（2）平衡

用约50mL的0.1mol/LTris-HCl，pH7.5缓冲液过柱平衡，流速2mL/min，直至流出液pH与缓冲液一致。

（3）亲和吸附：

取2mL充分打匀的新鲜鸡蛋清，加入10mL稀释，用电磁搅拌器打匀，过滤后上柱吸附，流速小于3滴/min。

（4）洗涤

用0.1mol/LTris-HCl，pH7.5缓冲液洗柱，流速小于2mL/min，直至流出液A280处读数不大于0.05。

再用0.01mol/LpH4.8乙酸缓冲液洗涤，流速1mL/min，直至流出液在A280的读数小于0.05。

（5）洗脱

用0.05mol/LPH2.5甘氨酸缓冲液进行洗脱，流速小于5滴/min，每管3mL收集，依次测定各管A280。

将峰值管收集液合并，得纯化的卵粘蛋白。

[结果和计算]

1、以A280为纵坐标，洗脱管号或洗脱收集液体积为横坐标，绘制洗脱曲线图。

2、计算上柱前和洗脱收集所得卵粘蛋白的蛋白质总量，求出蛋白回收率。