原发性肝癌组织双向电泳技术优化.docx

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原发性肝癌组织双向电泳技术优化

原发性肝癌组织双向电泳技术优化

【摘要】【目的】优化双向凝胶电泳的实验步骤，总结出一套适用于原发性肝癌组织的双向凝胶电泳技术。

【方式】对双向电泳实验中的关键环节：

样本处置、上样方式、聚焦条件等进行研究与优化，考马斯亮蓝染色后进行凝胶图像比较。

【结果】采纳7mmol/L尿素、2mol/L硫脲、40g/LCHAPS、100mmol/LDTT、5g/L（pH3-10）IPGbuffer，1mmol/LPMSF作为裂解液，丙酮沉淀蛋白，主动水化上样法，聚焦电压达到140kV能够取得分辨率高、重复性好的结果。

【结论】上述改良提高了2-D图谱中蛋白位点的分辨率和重复性，为原发性肝癌组织的蛋白质组学研究奠定了基础。

【关键词】原发性肝癌;蛋白质组学;双向电泳

　Abstract：

【Objective】Toestablishasetoftwo-dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis（2-DE）techniquesforproteomicresearchofhepatocellularcarcinoma（HCC）tissues.【Methods】Differentmethodsorconditionforkeyproceduresof2-DEwereadjustedandoptimized，includingsamplepreparation，sampleloadingmethods，iso-electronicfocusing（IEF），comparingwiththegelafterCommassiebluestaining.【Results】High-resolutionresultswithrepetitivenesscouldbeobtainedaccordingtothecondition：

7mmol/Lurea，2mmol/Lthisurea，4%CHAPS，100mmol/LDTT，%（pH3-10）IPGbuffer，1mmol/LPMSFaslysisbuffer，actoneprecipitateprotein，initiativerehydrationmethodandIEFto140kV.【Conclusion】Theoptimizedmethodprovided2-Dresultswithhighresolutionandrepetitiveness，whichpavethewayfortheproteomicresearchforHCCtissues.

　　原发性肝癌（以下简称肝癌）是我国最多见的恶性肿瘤之一，死亡率在我国恶性肿瘤中位居第二[1]。

蛋白质组学是研究肿瘤发生机制[2]，寻觅肿瘤标志物的重要工具，关于肝癌发生机制和医治作用靶点的研究具有重要意义[3]。

我国早在2003年就启动了人类肝脏蛋白质组打算（HUPO），并取得了必然的研究功效。

但关于肝癌组织双向电泳的技术却少完整系统的报导，为了成立高分辨率可重复的肝癌组织双向凝胶电泳技术，咱们对人肝癌组织的双向电泳技术中的关键环节进行了研究对照，优选出一套适合肝癌组织的双向凝胶电泳方式，供从事肝脏蛋白质组学双向电泳的技术人员参考。

　　1材料与方式

　　材料

　　标本搜集

　　原发性肝癌组织来自我院肝癌切除术患者。

组织离体后当即以预冷PBS冲洗，在冰上分装置入冻存管，液氮中速冻，后转入-80℃冰箱中保留备用。

所有病例均经术后病理证明为原发性肝细胞癌。

　　试剂

　　丙烯酰胺、甲叉双丙稀酰胺、过硫酸胺、四甲基乙二胺（TEMED）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）、3-[3-（胆酰氨基丙基）二甲氨基]丙磺酸盐（CHAPS）、二硫苏糖醇（DTT）、甘氨酸、IPG缓冲液（pH3～10）、蛋白酶抑制剂、碘乙酰氨（IAA）、硫脲、18cm胶条（pH3～10NL）均为Amersham公司产品。

TCA、丙酮为Sigma公司产品。

无水乙醇为国产分析纯（广州化学试剂厂），所有溶液均用去离子水配制。

　　要紧设备

　　ImmobilineDryStrip，EttanIPG3等电聚焦电泳仪，EttanDALTsix600垂直电泳槽，Imagescanner高密度扫描仪，ImageMaster软件均购自Amersham公司。

　　方法

　　蛋白质样品制备

　　粗样本制备：

取肝癌组织100mg，液氮冷冻研磨，加入mL裂解液（含10g/LPMSF蛋白酶抑制剂），裂解液（7mmol/L尿素、2mol/L硫脲、40g/LCHAPS、100mmol/LDTT、50g/L（pH3～10）IPGbuffer，1mmol/LPMSF），超声裂解，15℃，离心10min，取上清液，4℃，超速离心50min，躲开漂浮的脂质层，吸取离心上清4℃，再次离心50min;取上清。

Bradford法定量，分装后置-80℃保留。

为充分去除样本中含有的杂质对等电聚焦的阻碍，咱们采纳了经常使用的三种蛋白沉淀方式，并对结果进行对照。

①丙酮沉淀蛋白：

加入4倍体积的冰丙酮使蛋白在-20℃沉淀至少2h，4℃，离心15min，用裂解液重溶。

②三氯乙酸/丙酮沉淀：

将三氯乙酸加到提取组织液中，终质量浓度为100g/L，再加入4倍体积的冰丙酮使蛋白在-20℃沉淀至少2h，4℃离心15min，最后再用冰丙酮清洗沉淀，去除三氯乙酸，用裂解液重溶。

③Cleaning-up试剂盒沉淀蛋白：

按Amersham公司的试剂盒说明书操作，用裂解液重溶。

　　等电聚焦电泳

　　别离采取目前经常使用两种上样方式：

标准胶条槽上样（主动水化）及杯上样（被动水化），并对结果进行比较分析。

聚焦程序参考聚焦系统操作指南，同时利用软件对聚焦电压，电流进行检测，指导聚焦程序的调整，对不同聚焦方式进行比较分析（表1）。

　　第二向SDS电泳

　　（SDS-PAGE）等电聚焦后的胶条别离以SDS平稳缓冲液（第一次加入100mg/10mLDTT，第二次加入250mg/10mL碘乙酰胺）平稳两次，每次15min。

平稳后IPG胶条转移至电泳系统，用125g/L的胶进行二向电泳，每块胶2W，电泳50min后改成每块胶15W，电泳至溴酚蓝跑到凝胶底部。

凝胶进行热考马斯亮兰染色。

　　凝胶图像搜集与分析

　　染色后凝胶以Imagescanner高密度扫描仪获取图像，利用ImageMaster软件对图像进行蛋白质斑点自动检测，然后手工删除假点，添加未检出的斑点，最后进行斑点匹配，分析。

　　2结果

　　蛋白沉淀方式对电泳结果的阻碍

　　从图1可见，未经处置的样本蛋白点尽管很多（1920点），但分辨率很差。

丙酮，TCA-丙酮，Cleaning-up试剂盒沉淀后的样本与原始样本相较均有很多改善，但TCA-丙酮丢失的蛋白较多（1644点），丙酮（1856点），和Cleaning-up（1713点）丢失的蛋白较少。

图1B中，经TCA-丙酮沉淀后，酸性蛋白大量丢失。

图1C中，丙酮沉淀蛋白点数多且清楚，无明显拖带和条纹，背景干净清楚，说明蛋白质富集和纯化的成效都比较好。

　　不同聚焦条件对电泳结果的阻碍

　　图2中，A聚焦电压是80kV，B聚焦电压140kV。

由于聚焦时电流较高，将500V延长2h，1kV延长了1h，从图中可见B的聚焦成效比A有专门大改善。

图C是咱们监测的延长低压聚焦后（图B）的IEF电压走势图，从图中可见电压升至设定的80kV进行聚焦。

图2B蛋白点数较A明显增多，专门是酸性端，说明B聚焦成效明显好于A。

　　主动水化与被动水化上样的电泳结果

　　从图3中可看出，图A中的蛋白点数明显增多，点也更圆，而且没有图B中的横条纹。

说明主动水化比被动水化的聚焦成效更好。

　　3讨论

　　双向凝胶电泳（2-DE）由于其在展现全数蛋白质表达改变并鉴定特异性蛋白方面的优势，成为目前蛋白质组学研究首选的分离技术[4]，最近几年来取得了较大的进展与改善，但实验结果的重复性和稳固性仍有待提高[5]。

我国关于肝癌的蛋白质组学研究愈来愈多，由于肝癌组织成份复杂，干扰成份多，个体不同大使其双向电泳实验条件难以严格操纵[6]，目前尚没有针对该组织的双向电泳技术的方式学的系统报导，为此，咱们对肝癌组织蛋白的制备、一贯聚焦程序、上样方式等关键步骤进行研究对照，优化总结出一套可行的，重复性好的双向电泳方式，供大伙儿参考。

　　样品制备

　　蛋白质样品的制备是的关键环节，关系到蛋白质组研究结果的准确性[7]。

样本制备要紧包括蛋白提取与沉淀两个步骤。

蛋白提取进程需尽可能地溶解和解聚蛋白质[8]。

通常采纳分级提取蛋白的方式，可是繁琐的样品制备步骤容易造成样品中蛋白质组分的丢失[9]。

为了尽可能减少蛋白丢失，咱们采纳液氮冷冻研磨的方式提取蛋白。

另外，裂解液的选择也超级关键[10]。

目前经常使用的裂解液配方有两种：

第一种，7mmol/L尿素，4%（CHAPS），%的IPG，mmol/LDTT;第二种，将8mmol/L尿素改成7mmol/L尿素，2mmol/L硫脲[11]。

后者添加了硫脲，它能够增强蛋白的溶解，专门是溶解疏水蛋白。

Fialka在对小鼠乳腺上皮细胞亚细胞结构的蛋白提取中，添加了硫脲，取得一系列的亚细胞器膜蛋白的如跨膜蛋白Ecadherin等[12]。

为了尽可能取得肝癌组织的全蛋白，咱们采纳了含硫脲的裂解液。

　　蛋白沉淀，目前还有许多问题没有解决，如沉淀后蛋白的溶解，专门是一些疏水蛋白、低丰度蛋白等不容易重溶，而它们可能是药物的靶向位点，或是肿瘤细胞的表面抗原，在疾病发生进程中发挥重要的作用[13]。

肝癌样本中含有的脂肪、核酸和大量的盐分，阻碍等电聚焦。

盐离子在水化进程中容易渗入胶条，使凝胶内产生不均一的电流散布，致使双向电泳结果显现条纹和不均一背景[14]。

因此，必需采纳蛋白沉淀的方式去除这些杂质，才能顺利地完成聚焦。

目前，已有很多有关样本沉淀的报导，最常利用丙酮沉淀法，TCA-丙酮沉淀法，和商业化的Cleaning-upkit来沉淀蛋白，但沉淀的成效如何，却没人做过系统的比较分析。

本文将这三种沉淀方式都进行实验，TCA-丙酮沉淀法蛋白丢失较多，与它的作用原理有关。

蛋白质在pH值小于等电点的环境中带上正电荷，与TCA的酸根结合生成不溶盐而沉淀，再用丙酮将酸根完全抽提，取得较纯的蛋白质样品[15]。

因此它对碱性蛋白的富集成效较好，但对等电点小于溶液pH值的酸性蛋白富集成效差，有机溶剂的多次作用造成了蛋白质溶解性变差也加重了蛋白质的丢失。

图1B顶用TCA-丙酮沉淀后酸端蛋白丢失很明显。

　　丙酮沉淀法是通过降低水的介电常数，破坏蛋白质胶体的水化层，形成沉淀析出[16]。

可是，蛋白质分子在常温或升温时立体结构展开，丙酮极容易与其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸进行疏水结合致使蛋白变性，因此整个沉淀进程应利用预冷的丙酮[17]。

Cleaning-up试剂盒是商家进行改良后的沉淀法，也取得了专门好的电泳图谱，但相较之下，丙酮具有经济方便等优势，因此咱们推荐利用丙酮沉淀法。

　　聚焦程序

　　一贯聚焦是双向电泳成功的关键，但好的聚焦程序是如何试探出来的呢?

咱们的体会是第一依照IEF的原那么编排基础聚焦程序;再依照样本是不是除盐决定低压聚焦的步骤及时刻;最终的聚焦电压以5～8kV为适，聚焦时刻以10h为基础进行调整。

为了确保实验的重复性，最终聚焦要选择千伏终止。

另外，在IEF进程中，利用软件对聚焦时的电压，电流进行实时监测，指导低压聚焦时刻及步骤的调整。

如电流太高，可在低电压处延长聚焦时刻，利用低压达到除盐的成效。

　　上样方式

　　一贯等电聚焦最经常使用的上样方式包括主动水化和被动水化。

主动水化中，由于施加低电压有利于大分子蛋白的进入胶条[18]，可幸免杯上样所产生的渗漏问题。

被动水化法可任意调剂上样位置，因此专门适合偏酸或偏碱蛋白的聚焦;最高电流可达75?

滋A，因此对盐的耐受能力较强;同时具有幸免蛋白在长时刻的低电压水化进程中丢失等优势。

但有些蛋白质的等电点靠近上样处，迁移率及溶解性降低，易沉淀在上样杯处，在二相电泳中表现为在上样处形成条纹状。

实验时，应当依照样本类型和实验需要进行选择。

本实验中，肝癌组织蛋白要紧在pH3～10之间，通过比较，咱们选择主动水化。

　　蛋白质组学实验涉及的步骤很多，除上述关键步骤，还有凝胶浓度，染色方式的选择等。

实验时要依照感爱好的蛋白的分子量选择凝胶浓度，常规选择125g/L的凝聚;若是大分子质量的蛋白较多能够选择100g/L的凝胶，相反，若是小分子质量的蛋白多，那么选择150g/L的凝胶。

经常使用的染色方式有考染、胶体考染、银染、荧光染色等。

一样上样量大于300μg时可选择考染或胶体考染;上样量在100～300μg选择银染;小于100μg选择荧光染色。

　　我国肝癌组织蛋白质组学研究已有很多报导，但没有系统的总结双向电泳的方案。

本研究充分结合肝癌组织成份特点及双向电泳的具体要求，从双向电泳的全进程进行探讨，通过实验取得理想的双向电泳图谱，形成了一套用于肝癌蛋白质组学研究的稳固靠得住的双向电泳技术方案，供从事肝癌蛋白质组学研究人员参考，为进一步的蛋白质组学分析奠定基础。

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