双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立.docx

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双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立

双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立

　　摘要建立了双功能试剂2-[（4-异硫氰基苯基）甲基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸（p-SCN-Bn-DOTA）与标准肽段反应的新方法，测定了反应产物与镧系金属Eu的螯合效率，探索了其作为靶向探针和蛋白定量标记试剂性能。

考察了不同缓冲体系的浓度及pH值、p-SCN-Bn-DOTA量与肽段相对量、反应体系中有机相与水相比例，反应温度与反应时间对偶联效率的影响。

实验结果显示：

p-SCN-Bn-DOTA量为肽段的32倍，缓冲体系为0.2mol/LTEAB（pH8.5），60℃反应60min，有机相与水相之比为4.4∶1（V/V）时标记效率高；在HCl/NaAc缓冲体系（pH4.0）中60℃反应60min，金属离子鳌合反应效率高达94%。

本研究建立了一种新的基于双功能试剂p-SCN-Bn-DOTA的标记方法，并成功用于RGD肽等的标记。

　　关键词双功能试剂；标记；多肽；蛋白定量；质谱

　　2015-10-03收稿；2016-03-11接受本文系北京市自然科学基金（Nos.7143172，7143173）资助

　　E-mail：

shenjing69@

　　1引言

　　双功能试剂连接多肽并螯合金属元素，可以作为靶向探针结合分子影像技术用于肿瘤的靶向治疗研究[1]，还可以通过标记多种金属元素制备蛋白质组学多重定量试剂[2]，用于肿瘤标志物的筛选、鉴定、分类等研究。

因此双功能试剂在肿瘤研究方面具有良好的应用前景。

　　RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的短肽，基于靶向多肽RGD进行放射性核素标记可用于αvβ3（+）肿瘤的无创性检查以及判断患者是否适用于抗肿瘤血管形成治疗[3～5]。

此外，标记的小分子多肽具有生物相容性好、穿透性强、免疫原性低、作用快、易于实时监测的特点，可在基于靶向探针的蛋白的分析检测方面发挥独特优势[6，7]。

　　在肿瘤蛋白质组定量分析研究方面，目前已开发的方法有基于稳定同位素标记的方法，如ICAT[8]、18O酶切标记[9]、SILAC[10]、iTRAQ[11]等，但这些方法普遍存在同位素价格昂贵、标记难度较大、对质谱分析仪器具有选择性、同位素峰在质谱分析时会发生相互干扰等缺点，会给定量结果带来误差[12]。

因此探索非同位素标记的方法，开发具有我国自主知识产权的蛋白定量试剂具有重要意义。

文献[13～15]报道了针对肽段半胱氨酸标记设计的金属编码亲和标签。

徐明等[16]利用外源Hg标签标记硒蛋白/多肽，实现Se-Hg双元素标记选择性识别和检测硒蛋白/多肽。

但是在实际的蛋白质组学样本分析中，需要使用适用于所有肽段的标记方法。

Liu等[17]开发了基于双功能试剂二乙酸胺五乙酸的标记方法，实现了肽段的无歧视标记，但所选择的双功能试剂标记效率不高。

针对此问题，Wang等[18]用羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸（DOTA-NHS-ester）作为螯合试剂进行了初步研究，在此基础上，文献[12，19]对标记方法进行了优化，提高了金属标记效率。

　　虽然非同位素标记的方法已取得了进展，但是仍有以下几方面需要改进。

首先，DOTA-NHS-ester容易水解，在反应体系中，活化酯与NH2的标记反应和水解反应互相竞争，不利于反应体系中水相和有机相组成的确立。

其次，肽段中NH2与DOTA-NHS-ester是亲核取代反应，反应体系应在中性或偏碱性条件进行；而DOTA-NHS-ester在碱性条件下极易水解，水解产生酸，在一定程度上改变反应体系的pH值[20]。

因此，DOTA-NHS-ester的水解敏感性高不利于确立标记反应条件，对实际样本分析条件的限制很大，因此优化双功能试剂的意义重大。

　　2-[（4-异硫氰基苯基）甲基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸（p-SCN-Bn-DOTA）是一种被广泛应用的双功能螯合试剂，如与牛血清白蛋白（BSA）和鸡蛋清溶菌酶标记可用于肿瘤的检测[21]，与利妥昔单抗[22]或核糖核酸[23]反应标记可以用于抗肿瘤药的生物分布和显影的研究，还可以与聚乙二醇[24]标记得到胶束用于制剂研发等。

它的化学结构较DOTA-NHS-ester稳定，不易发生水解反应，这对于标记反应条件的确立十分有利，并可以通过螯合金属离子标记氨基多肽。

基于p-SCN-Bn-DOTA的标记方法的建立不仅有望开发一种新型的金属标记试剂，用于肿瘤蛋白质组学的多重定量分析，而且可将该试剂用于RGD肽的标记，从而有利于肿瘤受体显像剂的开发。

本研究建立了基于双功能试剂p-SCN-Bn-DOTA的螯合金属元素标记多肽新技术，并成功标记RGD等标准肽段。

　　2实验部分

　　2.1仪器与试剂

　　UltraflexII基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS，德国布鲁克公司）；DiscoveryDV215CD分析天平（美国OHAUS公司）；HQ-60涡旋混匀器（北方同正生物技术发展有限公司）；PMC-060掌上离心机（日本TOMY公司）。

　　α-氰基-4-羟基肉桂酸（德国布鲁克公司）；标准合成肽段LGEYGFQNALIVR由吉尔生化（上海）有限公司合成；RGD肽由北京中海康医药科技发展有限公司合成；三乙二胺碳酸盐（TEAB）、氯化铕（EuCl3）（美国Sigma-Aldrich公司）；p-SCN-Bn-DOTA（美国Macrocyclics公司）；其它试剂均为国产分析纯；实验用水为Milli-Q（美国Millipore公司）超纯水。

　　2.2实验方法

　　2.2.1p-SCN-Bn-DOTA与标准肽段的偶联反应100μL0.5μmoLp-SCN-Bn-DOTA溶于二甲基甲酰胺（DMF），50μL0.68μmoL肽段LGEYGFQNALIVR溶于TEAB。

将两种溶液以不同比例混合进行偶联反应，考察TEAB的浓度和pH值、DOTA与肽段的摩尔比、反应温度、反应时间等条件对偶联效率的影响。

其中肽段的终浓度始终为0.05nmol/μL。

称取RGD肽1mg，加DMF124μL，供p-SCN-Bn-DOTA与RGD肽的偶联反应。

　　2.2.2偶联产物与金属离子的螯合反应

　　向2.2.1中的反应体系加入5μL0.1mol/LEuCl3溶液（盐酸-乙酸钠缓冲液或乙酸-乙酸铵缓冲液），再分别加入相应的不同pH值的缓冲液50μL，考察pH值、反应温度、反应时间对螯合效率的影响。

　　2.2.3MALDI-TOF-MS分析

（1）干点法点样取1μL分析样品点于Groundsteel靶板上，自然干燥后，再点5mg/mLCHCA基质溶液（0.1%TFA-50%乙腈溶液）1μL，自然干燥后进行质谱分析。

（2）薄层法点样先在靶板上点0.5μLCHCA基质的乙醇过饱和溶液，自然干燥后，再点1μLCHCA基质溶液（5mg/mL，0.1%TFA-50%乙腈溶液）和样品的混合溶液。

采用PeptideCalibstandardmono作为标准品校正，相对标准偏差≤5ppm。

质谱数据采集采用反射模式。

仪器控制软件为FlexControlsoftwareverion3.0，数据处理软件为FlexAnalysissoftwareverion3.0。

　　3结果与讨论

　　3.1双功能试剂的选择

　　目前针对巯基的金属元素标记方法较多，标记氨基的金属元素标记方法研究较少，已有的标记N-端氨基的方法有转氨法等，如先将蛋白的游离N-端氨基转化为活性的羰基，然后与连有肼的荧光基团反应得到标记分子[25]。

氨基的金属标记，理论上可以标记所有的肽段，对所有的肽段和蛋白质（含巯基和不含巯基的）都能进行定量研究[2，20，26，27]。

p-SCN-Bn-DOTA是一种双功能螯合试剂，可与肽段的氨基共价结合，并通过络合反应螯合金属离子，与Wang等[18]采用的DOTA-NHS-ester相比，其结构稳定，不易水解，既能够明确反应体系中水相和有机相的比例，又有利于确定反应体系的pH值，这些均利于标记反应条件的确立。

　　3.2金属元素和标准肽段的选择

　　p-SCN-Bn-DOTA可与多种稀土金属离子形成螯合物，其中与镧系金属离子形成的螯合物稳定性最佳[28]，故选镧系金属离子Eu作为螯合标签。

　　标准肽段的选择应具有典型性，由于实际的生物样本大多是通过胰酶酶解成肽段，肽段C端是精氨酸（R）或者赖氨酸（K），故选用常用的标准蛋白牛血清白蛋白的胰酶酶解肽段LGEYGFQNALIVR作为标准肽段之一；RGD肽由于在肿瘤诊断和治疗中的重要意义而被选作为标准肽段。

　　3.3肽段的金属元素标记反应原理

　　肽段的金属元素标记反应的原理如图1所示，首先是肽段的氨基与p-SCN-Bn-DOTA发生共价反应，反应产物再与镧系金属元素形成稳定螯合物。

　　以产物和反应物的MALDI-TOF-MS质谱峰峰面积计算标记反应的效率，标记效率（%）=产物峰面积/（产物峰面积+原肽峰面积）×100%。

　　3.4p-SCN-Bn-DOTA与标准肽段偶联反应的优化

　　3.4.1缓冲体系对p-SCN-Bn-DOTA标记反应的影响考察了3种缓冲体系NaHCO3-Na2CO3体系、DMF-三乙胺体系以及三乙二胺TEAB体系。

对于0.5mol/LNaHCO3-Na2CO3缓冲液（pH8.8），由于反应产物盐浓度过高，需要稀释50倍以上才能被MALDI-TOF检测到，而且钠盐是不可挥发性盐，Na+对质谱可能产生的干扰不易去除。

Scheinberg等[29]将p-SCN-Bn-DOTA与肽段GGGFC在无水的DMF-三乙胺体系中反应，但是实际的生物样品酶解产物是含水的体系，因此纯有机溶剂的DMF-三乙胺体系不适用于生物样品酶解产物分析。

而TEAB是可挥发性碳酸盐，p-SCN-Bn-DOTA与肽段LGEYGFQNALIVR（m/z1479）可以在TEAB缓冲体系中反应生成标记产物（m/z2031），而且结晶状态好，适合质谱检测，因此，选择TEAB体系进行后续实验条件优化。

　　3.4.2p-SCN-Bn-DOTA的量与肽段量的比例、反应温度、反应时间对标记反应的影响由于标记反应中影响标记效率的因素众多[30，31]，本研究考察了p-SCN-Bn-DOTA量与肽段量的比例、反应温度、反应时间等因素，结果如表1所示。

由表1可见，p-SCN-Bn-DOTA和肽段的摩尔比为32倍，在60℃反应60min时，标记效率最高，因此选择上述条件为最佳反应条件。

与文献[20]报道的DOTA-NHS-ester50倍过量于肽段、肽段的终浓度为0.125nmol/μL相比，本方法反应试剂的用量少，而且适用的肽段的浓度更低，显示出更高的标记灵敏度。

肽段和标记产物的质谱图如图2所示。

　　3.4.3反应体系中有机相与水相比例的考察实验条件优化过程中，为保证肽段的终浓度一致，需要改变有机相和水相的比例来实现其它参数的调整。

实验过程中发现，在一定范围内，反应体系中水的比例越高，标记效率越低，最佳有机相与水相之比为4∶1～5∶1（V/V）。

　　3.4.4缓冲体系浓度及pH值对反应的影响缓冲体系浓度及pH值是影响螯合剂配位能力的主要因素。

本研究考察了0.1，0.2和0.5mol/LTEAB缓冲溶液在pH值分别为6.5，7.5，8.5，9.5时DOTA与肽段的偶联效率，用三乙胺和冰醋酸调节pH值。

结果表明，缓冲体系为0.2mol/LTEAB，pH8.5的条件下偶联效率较高，且重现性好。

　　3.5p-SCN-Bn-DOTA与RGD肽的偶联反应

　　按照2.2.1节实验方法制备RGD肽，在优化的条件下，即缓冲体系为0.2mol/LTEAB（pH8.5），与p-SCN-Bn-DOTA在60℃进行偶联反应60min，实验结果如图3所示，标记效率为90.6%。

　　3.6反应温度、反应时间及pH值对螯合反应的影响

　　对于EuCl3与DOTA偶联产物的标记反应，分别考察了乙酸铵-乙酸（HAc-NH4Ac），盐酸-乙酸钠（HCl-NaAC）反应体系；反应温度为30℃，60℃和100℃；反应时间为15和60min；pH值为4.0和5.5时的标记效率。

结果如表3及图4所示，其中在pH4.0的HCl-NaAC缓冲液中，60℃反应60min标记效率最高，而且酸性条件下（pH4.0），可以减少金属离子和肽段的非特异性结合。

　　3.7MALDI检测方法的考察

　　对用于MALDI检测的样品点样方法进行了考察，比较了干点法和薄层法两种方法。

如图5所示，结果显示干点法相对较好，结晶状态均匀，样品检测灵敏度高。

　　4结论

　　本研究通过双功能试剂p-SCN-Bn-DOTA与RGD等标准肽段反应，考察与镧系金属元素Eu螯合效率，对螯合稀土金属标记肽段的反应条件进行了优化。

p-SCN-Bn-DOTA与标准肽段反应的条件为：

DOTA为肽段的32倍，缓冲体系为0.2mol/LTEAB，pH8.5，反应温度60℃，反应时间为60min；偶联产物与金属离子反应的条件为：

pH4.0的HCl/NaAC缓冲体系中反应60min。

MALDI-TOF检测时样品点样方法使用干点法较好。

本研究结果表明，p-SCN-Bn-DOTA在标记RGD等多肽上有良好的应用，有望成为一种新的高灵敏度金属标记试剂和肿瘤受体显像剂。

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