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附录8检测方法

附录1

动物性食品中金刚烷胺残留量的测定液相色谱-串联质谱法

1范围

本标准规定了动物性食品中金刚烷胺残留量检测的制样和液相色谱－串联质谱测定方法。

本标准适用于猪、鸡和鸭的可食性组织（肌肉、肝脏和肾脏）及禽蛋中金刚烷胺残留量的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T1.1-2009标准工作导则第1部分：

标准的结构和编写规则

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

试样中残留的金刚烷胺用1%乙酸乙腈溶液提取，正己烷液液分配去脂，基质固相分散净化，液相色谱-串联质谱正离子模式测定，内标法定量。

4试剂和材料

以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。

4.1金刚烷胺标准品，含量≥98.0%。

4.2D15-金刚烷胺标准品，含量≥99.0%。

4.3甲醇：

色谱纯。

4.4乙腈：

色谱纯。

4.5正己烷：

色谱纯。

4.6冰乙酸。

4.7甲酸：

色谱纯。

4.8无水硫酸钠。

4.91%乙酸乙腈溶液：

取冰乙酸10mL，用乙腈稀释至1000mL。

4.1050%乙腈水溶液：

取50mL乙腈，用水稀释至100mL。

4.110.1%甲酸水溶液：

取1mL甲酸，用水稀释至1000mL。

4.12金刚烷胺、D15-金刚烷胺标准贮备液：

分别精密称取10mg金刚烷胺和D15-金刚烷胺标准品分别于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的金刚烷胺和D15-金刚烷胺标准贮备液，-20℃以下保存，有效期3个月。

4.13金刚烷胺、D15-金刚烷胺标准工作液：

分别精密量取1mg/mL的金刚烷胺和D15-金刚烷胺标准贮备液0.1mL，分别于100mL容量瓶中用甲醇稀释至刻度，配制成金刚烷胺浓度为1µg/mL，D15-金刚烷胺浓度为1µg/mL的标准工作液，28℃保存，有效期2周。

4.14净化吸附剂：

PSA（乙二胺-Ｎ-丙基硅烷），粒度40µm。

5仪器和设备

5.1液相色谱－串联质谱仪且配有电喷雾离子源（ESI）。

5.2天平：

感量0.01g。

5.3分析天平：

感量0.00001g。

5.4均质机。

5.5涡旋混合器。

5.6旋转蒸发仪。

5.7离心机：

转速3000r/min。

5.8高速离心机：

转速10000r/min。

5.9氮吹仪。

5.10滤膜：

0.22µm。

5.11针式过滤器：

内填有50mg的PSA净化吸附剂，滤膜孔径0.22µm。

6试料的制备与保存

6.1试料的制备

取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。

取适量新鲜或冷藏的空白或供试禽蛋，去壳后混合均匀。

取匀浆后的供试样品，作为供试试料。

取匀浆后的空白样品，作为空白试料。

取匀浆后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。

6.2试料的保存

-20℃以下保存。

7测定步骤

7.1提取

称取试料2.00.05g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入D15-金刚烷胺标准工作液20l。

然后加入1%乙酸乙腈溶液10mL，漩涡2min，3000r/min离心5min，上清液转入另一50mL离心管中，重复提取一次，合并两次上清液，备用。

7.2净化

备用液中加入无水硫酸钠3g，正己烷10mL，涡旋1min，3000r/min离心5min，弃去正己烷层，剩余溶液转至100mL鸡心瓶中，40℃水浴下旋转蒸干，用1.0mL甲醇溶解残渣。

（1）加入PSA50mg，涡旋30s，取上清液过滤膜至1.5mL试管中；或者

（2）直接匀速通过针式过滤器，呈滴状流入1.5mL试管中。

量取滤液0.5mL于离心管中，40℃氮气吹干，加入50%乙腈水溶液0.5mL，涡旋30s，10000r/min离心5min，取上清液供上机测定。

7.3标准曲线的制备

溶剂标准溶液：

准确量取金刚烷胺和D15-金刚烷胺标准工作液适量，用50%乙腈水溶液稀释配制成金刚烷胺浓度为2、4、10、20、100、200µg/L，D15-金刚烷胺浓度均为20µg/L的金刚烷胺系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱测定。

基质匹配标准溶液：

取空白猪肝和猪肾试料，除不加D15-金刚烷胺标准工作液外，均按上述方法处理分别制得其空白基质溶液，准确量取金刚烷胺和D15-金刚烷胺标准工作液适量，分别用猪肝和猪肾的空白基质溶液稀释，配制成金刚烷胺浓度为2、4、10、20、100、200µg/L，D15-金刚烷胺浓度均为20µg/L的系列猪肝和猪肾基质匹配标准溶液，临用现配，供液相色谱-串联质谱测定。

7.4测定

7.4.1色谱条件

色谱柱：

C18，1502.1mm，粒径3.5μm，或相当者；

流动相：

A为0.1％甲酸水溶液，B为甲醇；

流速：

0.3mL/min；

进样量：

10µL；

预平衡时间：

2min；

流动相梯度洗脱程序见表1：

表1梯度洗脱程序

时间（min）

A（%）

B（%）

曲线类型

1.5

维持不变

线性变化

维持不变

5.1

线性变化

维持不变

7.4.2质谱条件

离子源：

电喷雾离子源；

扫描方式：

正离子扫描；

检测方式：

多反应离子监测（MRM）；

脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体。

喷雾电压、碰撞能等参数应优化至最优灵敏度。

监测离子参数情况见表2。

表2金刚烷胺和D15-金刚烷胺特征离子参考质谱条件

化合物

定性离子对

m/z

定量离子对

m/z

去簇电压

（DP）/V

碰撞能

（CE）/eV

金刚烷胺

152.0>135.0

152.0>93.0

D15-金刚烷胺

167.3>150.3

7.4.3定性测定

通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。

试样与标准品保留时间的相对偏差不大于5%；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断试样中存在金刚烷胺残留。

表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度

>50%

>20%至50%

>10%至20%

≤10%

允许的相对偏差

±20%

±25%

±30%

±50%

7.4.4定量测定

取试样溶液、溶剂标准溶液或基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，按内标法以峰面积比定量，标准溶液及试样溶液中金刚烷胺和D15-金刚烷胺峰面积比均应在仪器检测的线性范围内。

在上述色谱-质谱条件下，典型的金刚烷胺标准溶液、空白试样溶液和空白试样添加金刚烷胺溶液中特征离子的质量色谱图分别见附录A。

7.5空白试验

除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行测定。

8结果计算和表述

单点校准：

…………………………………

（1）

或标准曲线校准，由：

……………………………………………

（2）

求得a和b，则

……………………………………………（3）

试料中金刚烷胺的残留量（μg/kg）按下式计算：

………………………………………………………（4）

式中：

X──供试试样中金刚烷胺残留量，µg/kg。

Ci──试样溶液中金刚烷胺浓度，µg/L。

Cis──试样溶液中D15-金刚烷胺浓度，µg/L。

Cs──标准溶液中金刚烷胺浓度，µg/L。

C'is──标准溶液中D15-金刚烷胺浓度，µg/L。

Ai──试样溶液中金刚烷胺峰面积。

Ais──试样溶液中D15-金刚烷胺峰面积。

As──标准溶液中金刚烷胺峰面积。

A'is──标准溶液中D15-金刚烷胺峰面积。

V──溶解残渣的甲醇体积，mL。

m──供试试样的质量，g。

注：

计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

9检测方法的灵敏度、准确度和精密度

9.1灵敏度

本方法的检测限为1µg/kg，定量限为2µg/kg。

9.2准确度

本方法在2µg/kg～100µg/kg添加浓度水平上的回收率为70%～120%。

9.3精密度

本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。

附录A

（资料性附录）

D15-金刚烷胺

（167.3>150.3）

金刚烷胺

（152.0>135.0）

金刚烷胺

（152.0>135.0）

附图A.1金刚烷胺标准溶液特征离子质量色谱图（4μg/L）

D15-金刚烷胺

（167.3>150.3）

附图A.2空白猪肉试样特征离子质量色谱图

D15-金刚烷胺

（167.3>150.3）

金刚烷胺

（152.0>135.0）

附图A.3空白猪肉添加金刚烷胺特征离子质量色谱图（2μg/kg）

附录2

动物性食品中四环素类药物残留量的测定液相色谱法

1.范围

本标准规定了动物性食品中四环素类药物残留量检测的制样和液相色谱的测定方法。

本标准适用于猪、牛、羊、鸡的肌肉、肝脏和肾脏，猪和鸡的皮+脂肪和鸡蛋、牛奶、鱼肌肉、虾肌肉中土霉素、四环素、金霉素、多西环素残留量的检测。

2.规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3.原理

试样中残留的四环素类药物，经EDTA·2Na-Mcllvaine缓冲溶液提取，HLB固相萃取柱串联LCX固相萃取柱净化，高效液相色谱-紫外法测定，以外标法定量。

4.试剂与材料

以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。

4.1盐酸土霉素标准品：

含量≥97.0%；盐酸四环素标准品：

含量≥97.5%；盐酸金霉素标准品：

含量≥93.1%；盐酸多西环素标准品：

含量≥98.2%。

4.2甲醇：

色谱纯。

4.3乙腈：

色谱纯。

4.4三氟乙酸

4.5二氯甲烷

4.6乙二胺四乙酸二钠

4.7枸橼酸

4.8磷酸氢二钠

4.9草酸

4.10硫酸

4.11钨酸钠

4.12HLB固相萃取柱：

500mg/6ml，或相当者。

4.13LCX固相萃取柱：

500mg/6ml，或相当者。

4.140.1mol/L柠檬酸溶液：

取柠檬酸21.01g，用水溶解并稀释至1000mL。

4.150.2mol/L磷酸氢二钠溶液：

取磷酸氢二钠71.63g，用水溶解并稀释至1000mL。

4.16Mcllvain缓冲溶液（pH＝4.0）：

取0.1mol/L枸橼酸溶液1000mL、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液625mL，混匀，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至4.0±0.05。

4.17EDTA·2Na-Mcllvaine缓冲溶液：

取乙二胺四乙酸二钠60.5g，加Mcllvaine缓冲溶液1625mL，溶解，混匀。

4.180.01mol/L草酸溶液：

取草酸1.26g，用水溶解并稀释至1000mL。

4.190.01mol/L三氟乙酸溶液：

取三氟乙酸0.8mL，用水溶解并稀释至1000mL。

4.200.34mol/L硫酸溶液：

取硫酸1.85mL，用水溶解并稀释至100mL。

4.217%钨酸钠溶液：

取钨酸钠7g，用水溶解并稀释至100mL。

4.221mol/L草酸溶液：

取草酸12.6g，用水溶解并稀释至100mL。

4.231mol/L草酸-乙腈溶液：

取1mol/L草酸溶液20mL，用乙腈溶解并稀释至100mL。

4.241mg/mL土霉素、四环素、金霉素和多西环素标准贮备液：

取盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素和盐酸多西环素标准品各约10mg，精密称定，分别于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的土霉素、四环素、金霉素和多西环素标准贮备液，-20℃以下保存，有效期1个月。

4.2510µg//mL土霉素、四环素、金霉素和多西环素标准贮备液：

准确量取1mg/mL土霉素、四环素、金霉素和多西环素标准贮备液各1mL，于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10µg/mL的土霉素、四环素、金霉素和多西环素混合标准工作液。

2～8℃保存。

现用现配。

5.仪器和设备

5.1高效液相色谱仪：

配紫外检测器。

5.2分析天平：

感量0.00001g。

5.3天平：

感量0.01g。

5.4组织匀浆器

5.5旋涡混合器：

3000r/min。

5.6低温离心机：

4000r/min。

5.7固相萃取装置。

5.8氮吹仪

5.9尼龙微孔滤膜：

0.22µm。

5.10离心管：

50mL。

5.11刻度试管：

分度值0.1mL。

6.试料的制备与保存

6.1试料的制备

6.1.1组织

取适量新鲜或解冻的空白或供试组织（鱼，去鳞，去皮，沿脊背取肌肉；虾，去头，去壳，去肠线，取肌肉部分），绞碎，并使均质。

——取均质的供试样品，作为供试试料。

——取均质的空白样品，作为空白试料。

——取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。

6.1.2牛奶

取适量新鲜或解冻的空白或供试牛奶，混合均匀。

——取均质的供试样品，作为供试试料。

——取均质的空白样品，作为空白试料。

——取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。

6.1.3鸡蛋

取适量新鲜的供试鸡蛋，去壳，并使均质。

——取均质的供试样品，作为供试试料。

——取均质的空白样品，作为空白试料。

——取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。

6.2试料的保存

-18℃以下保存，3个月内进行分析检测。

7.测定步骤

7.1提取

7.1.1脂肪

称取试料（5±0.05）g，于50mL离心管中，加二氯甲烷15mL，涡旋1min，振荡5min，加EDTA·2Na-Mcllvaine缓冲溶液15mL，涡旋1min，振荡5min，8500r/min离心5min，取上清液。

下层溶液加EDTA·2Na-Mcllvaine缓冲溶液30mL分两次萃取，合并三次上清液，中性滤纸过滤后，备用。

7.1.2肌肉、肝脏、肾脏、牛奶、鸡蛋

称取试料（5±0.05）g，于50mL离心管中，加EDTA·2Na-Mcllvaine缓冲溶液20mL，涡旋1min，振荡10min，加0.34mol/L硫酸溶液5mL、7%钨酸钠溶液5mL，涡旋1min，8500r/min离心5min，取上清液。

残渣用EDTA·2Na-Mcllvaine缓冲溶液20mL、10mL重复提取两次，合并三次上清液，中性滤纸过滤后，备用。

7.2净化

HLB柱依次用甲醇5mL、水5mL和EDTA·2Na-Mcllvaine缓冲溶液5mL活化，取备用液过柱，待全部备用液流出后，依次用水10mL、5％甲醇溶液10mL淋洗，抽干30s，用甲醇6mL洗脱，收集洗脱液于刻度试管中，加水2mL，混匀，过甲醇5mL、水5mL活化的LCX柱，待全部液体流出后，用水5mL、甲醇5mL淋洗，抽干1min，1mol/L草酸-乙腈溶液6mL洗脱，收集洗脱液，于40℃水浴氮气吹至0.5～1.0mL，再加甲醇0.4mL，用0.01mol/L草酸溶液定容至2.0mL，滤过，高效液相色谱测定。

（上机溶液应在24小时内完成测定。

）

7.3标准曲线的制备

精密量取10µg/mL混合标准工作液适量，用0.01mol/L草酸溶液稀释成浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5μg/mL的系列混合标准液，供高效液相色谱测定。

以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

求回归方程和相关系数。

7.4测定

7.4.1液相色谱参考条件

色谱柱：

C18（150mm×4.6mm，粒径5μm），或相当者。

流动相：

A：

0.01mol/L三氟乙酸溶液，B：

乙腈；梯度洗脱，见表1。

检测波长：

350nm

进样量：

50µL

柱温：

30℃

表1流动相梯度洗脱条件

时间

min

流速

mL/min

Curve

1.0

7.4.2测定法

取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以峰面积计算。

标准溶液及试样溶液中四环素类药物响应值应在仪器检测的线性范围之内。

在上述色谱条件下，标准溶液和空白添加试样溶液的高效液相色谱图分别见附录A。

7.5空白试验

除不加试料外，均按上述测定步骤进行。

8.结果计算和表述

试样中四环素类药物的残留量（µg/kg），按下式计算

式中：

X——试料中相应的四环素类药物的残留量，μg/kg；　

A——试料中相应的四环素类药物的峰面积；

As——标准溶液中相应的四环素类药物的峰面积；

Cs——标准溶液中相应的四环素类药物的浓度，μg/L；　

V——最终试样定容体积，mL；

m——供试试料质量，g。

注：

计算结果需扣除空白值。

测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

9.检测方法的灵敏度、准确度和精密度

9.1灵敏度

本方法在猪、牛、羊、鸡的肌肉、鸡蛋、牛奶、鱼肌肉、虾肌肉中检测限为20µg/kg，定量限为50µg/kg；在猪、牛、羊、鸡的肝脏、肾脏、猪和鸡的皮+脂肪的检测限为50µg/kg，定量限为100µg/kg。

9.2准确度

本方法在猪、牛、羊、鸡的肌肉组织50～200µg/kg添加浓度的回收率为60%~120%，在猪、牛、羊、鸡的肝脏组织100～600µg/kg添加浓度的回收率为60%~120%，在猪、牛、羊、鸡的肾脏组织100～1200µg/kg添加浓度的回收率为60%~120%，猪和鸡的皮+脂肪组织100～600µg/kg添加浓度的回收率为60%~120%，鱼肌肉和虾肌肉50～200µg/kg添加浓度的回收率为60%~120%，在牛奶50～200µg/kg添加浓度的回收率为60%~120%，在鸡蛋50～400µg/kg添加浓度的回收率为60%~120%。

9.3精密度

本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。

附　录　A

（资料性附录）

表

图A1四环素类药物标准溶液色谱图（750µg/L）

图A2猪肝脏组织空白试样色谱图

图A3猪肝脏组织空白添加四环素类药物色谱图（300µg/kg）

注：

OTC为土霉素，TC为四环素，CTC为金霉素，DOTC为多西环素

附录3

动物性食品中甲硝唑、地美硝唑及其代谢物残留检测

液相色谱–串联质谱法

1范围

本标准规定了动物源食品中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱方法。

本标准适用于猪肉、猪肝、鸡肉、鸡肝中的甲硝唑、地美硝唑、甲硝唑的代谢产物羟基甲硝唑、地美硝唑的代谢产物羟基地美硝唑残留量的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法

3制样

3.1样品的制备

取新鲜或解冻的空白或供试组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。

3.2样品的保存

-20℃冰箱中贮存备用。

4测定方法

4.1方法原理或提要

用乙酸乙酯提取试样中的硝基咪唑类药物及其代谢物，经0.1mol/L盐酸溶液-正己烷液液分配除脂，再经MCX固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法检测，色谱保留时间和质谱碎片离子共同定性，外标法定量。

4.2试剂和材料

以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。

4.2.1乙酸乙酯色谱纯

4.2.2乙腈色谱纯

4.2.3甲醇色谱纯

4.2.4浓盐酸

4.2.5正己烷色谱纯

4.2.6氨水

4.2.7乙酸色谱纯

4.2.8MCX固相萃取柱规格为60mg

4.2.9甲硝唑（MNZ）纯度≥98%

4.2.10地美硝唑（DMZ）纯度≥98%

4.2.11羟基甲硝唑（MNZOH）纯度≥94%

4.2.12羟基地美硝唑（HMMNI）纯度≥94%

4.2.13盐酸（0.1moL/L）

取8.3mL浓盐酸于1000mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度。

4.2.14硝基咪唑类药物及其代谢物标准储备液（100μg/mL）

分别称取甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟基地美硝唑各0.01g，用甲醇溶解定容至100mL，-20℃下保存，有效期6个月。

4.2.15硝基咪唑类药物及其代谢物混合标准溶液（10μg/mL）

取100μg/mL硝基咪唑类药物标准储备液5mL于50mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，-20℃下保存，有效期6个月。

4.2.16硝基咪唑类药物及其代谢物标准工作液

取适量的10μg/mL硝基咪唑类药物混合标准溶液，用甲醇稀释成适宜浓度的标准工作液，4℃冰箱中保存，有效期1个月。

4.3仪器和设备

4.3.1液相色谱-串联质谱仪

4.3.2组织匀浆机

4.3.3天平感量0.01g和感量0.00001g

4.3.4涡旋振荡混合器

4.3.5固相萃取装置

4.3.6离心机

4.3.7氮气吹干装置

4.4测定步骤

4.4.1提取

称取（2.0±0.02）g试样于50mL离心管中，加15mL乙酸乙酯，涡动2min，4000r/min离心5min。

上清液转移至另一50mL离心管中，残渣用15mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次提取液，20℃水浴氮气吹干。

4.4.2净化

加0.1mol/L盐酸5mL，涡动1min充分溶解残渣，加5mL正己烷，手摇20次，4000r/min离心5min，弃正己烷层。

下层再加5mL正己烷重复去脂一次，除尽正己烷层，备用。

MCX固相萃取柱依次用2mL甲醇和2mL0.1mol/L盐酸活化，取备用液全部过柱，再依次用2mL0.1mol/L盐酸、1mL甲醇、1mL2%氨水淋洗，用2mL甲醇-水-氨水（80-15-5）洗脱。

洗脱液2

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