常用载体构建说明书.docx

1、常用载体构建说明书常用载体构建说明书步骤：一、基本耗材准备（抗生素、LB液体培养基、LB固体培养基、离心管、枪头、三角瓶）二、制备感受态大肠杆菌三、设计引物四、Pcr扩增五、Pcr产物检测六、Pcr产物回收七、双酶切pcr产物和质粒八、酶切产物回收九、目的基因与载体连接十、转化感受态大肠杆菌十一、单克隆检测十二、测序比对十三、提质粒十四、酶切验证十五、转化感受态农杆菌十六、单克隆检测十七、侵染液配制一、基本耗材准备1、抗生素的制备（抗生素为索来宝公司） 常用抗生素 Kan（卡那） Amp（氨苄） Rif（利福平）母液浓度 ：Kan 50mg/ml Amp 100 mg/ml Rif 100 m

2、g/ml工作浓度：Kan 50ng/ul Amp 100 ng/ul Rif 100 ng/ul举例：称取kan固体1g 于注射器中，加入20ml ddH2O，溶解后用过滤器注入灭过菌的离心管中，-20度保存，使用比例1:1000注意：Rif溶解时加入DMSO2、培养基的配制LB液体培养基1000ml 200ml牛肉膏 5g 1g蛋白胨 10g 2g氯化钠 10g 2gLB固体培养基1000ml 200ml牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂粉5g10g10g15g1g2g2g3g120高温高压灭菌15-20min，固体培养基冷却后加入相应抗性，加入比例1:1000，然后把培养基倒90cc的培养皿中，一般情

3、况下一个培养皿可倒20ml培养基。3、离心管、枪头、三角瓶0.2ml、1.5ml、2.0ml离心管各200-500个，50ml离心管2个10ul、200ul、1000ul 枪头各2盒50ml、100ml、250ml 、500ml三角瓶各2个去离子水或双蒸水500ml二、制备感受态大肠杆菌（所用超级感受态细胞制备试剂盒购于上海生工）BT Media 培养基制备：1支BT Media加50 ml蒸馏水配制，放入250ml三角瓶，高压灭菌即可准备工作：将BT Buffer A和BT Buffer B 放冰上遇冷，遇冷低温离心机至41、用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线，置37培养箱中静置培

4、养12-16h待菌落生长到1-2mm大小。2、挑取一个正常生长的菌落，接种至10-15ml液体LB培养基中，于37摇床充分震荡（200rpm）培养2-16h。3、将上述活化好的菌液0.5ml接种至准备好的50ml BT Media中，于37摇床充分振荡培养至菌液OD600=0.5-0.6（注意监测菌液OD值，通常所需2-3h）。4、将菌液至50ml离心管中，冰上放置5-10min。5、于4，3500-5000rpm离心5min收集菌体沉淀。6、每50ml培养物菌体沉淀用16ml冰上预冷的BT Buffer A轻柔充分重悬菌体，冰上放置10-15min。7、于4，3500-5000rpm离心2-

5、5min收集菌体沉淀。8、每50ml培养物菌体沉淀用4ml冰上预冷的BT Buffer B轻柔充分重悬菌体，按每管100ul分装到冰上遇冷的1.5ml离心管中。9、 直接用于转化或用液氮冻后于超低温中保存。三、设计引物以CUB表达载体为骨架，cox2c 为插入基因为例1、分析插入区域可选酶切位点载体可选酶切位点:Eco53kI、SacI、XmaI、SmaI、BamHI查看目的基因上是否含有上述酶切位点，以SacI为例，查找结果如下：目的基因上没有SacI酶切位点，则SacI可作为候选的酶切位点之一。同理，BamHI也可作为候选的酶切位点之一。（同时这两个酶为常见酶，实验室有保存）因此，选取的酶

6、切位点为SacI和BamHI，且BamHI在前，SacI在后。2、查看保护碱基在网页上搜索保护碱基表，由于设计引物方向为5，到3，端，我们选的保护碱基为识别位点前黑色部分，及BamHI为cg或cgc，SacI为c3、确定左右引物长度根据Snapgene view 选取目的基因合适长度， 左引物组成： 保护碱基+酶切位点1+目的基因序列（ATG开始）Cg ggatcc ATGATGATGATGACTAGATGGAGTTCC利用Ssrhunter 对选取目的基因序列反向互补右引物组成： 保护碱基+酶切位点2+目的基因序列（终止密码子开始）C gagctc TTAGTTGGTTTGGAGGATTAA

7、TTGATTGGAT4、引物命名为试验方便，一般引物命名为：酶切位点+目的基因+左或右，这样可根据名称看出基因、酶切位点及左右引物如：BamHI-cox2c左 Cg ggatcc ATGATGATGATGACTAGATGGAGTTCCcox2c-SacI右 C gagctc TTAGTTGGTTTGGAGGATTAATTGATTGGAT四、用高保真酶进行pcr扩增于灭菌pcr管中配制如下反应体系，一般设置两个重复ddh2o To 50ul2xPhanta Max Buffer 25ulDntp Mix（10mM each） 1ul模板DNA Xul引物1 2ul引物2 2ulPhanta Ma

8、x Super-Fidelity DNA Polymerase 1ul模板DNA推荐使用量：基因组DNA，50-400ng；质粒或病毒DNA，10pg-30ng；cDNA，1-5ul反应体系循环步骤温度时间循环数预变性9530sec/3min1变性9515sec25-35退火56-7215sec延伸7230-60sec/kb彻底延伸725min1预变性时间：质粒或病毒DNA30sec，基因组或cDNA3min五、Pcr产物检测10X TBE称取1.0g琼脂糖放入250ml三角瓶中，加入100ml 0.5XTBE，微波炉中加热煮沸2.5min，放入凉水冷却2-3min，待冷却后加入8滴EB，摇晃

9、均匀后倒入胶槽，插上梳子，凝固后（10min左右），用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，一般点样量为5ul，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。(注意:加样前要先记下加样的顺序)，电压150-200V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，当Marker移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带。采用凝胶成像系统拍照保存。 六、Pcr产物回收1、提前在65-70预热ddH2O或者Elution Buffer2、将有目的条带的剩余pcr产物收集至1.5

10、ml灭菌离心管中，以1:5体积比加入pcr产物结合液CP3、将上述混合液混匀后转移到吸附柱中，室温放置1min，12000rpm离心40-60sec，倒掉收集管中的废液4、加入700ul wash buffer，12000rpm离心40-60sec，倒掉收集管中的废液5、加入500ul wash buffer，12000rpm离心40-60sec，倒掉收集管中的废液6、12000rpm空柱离心3min7、取出吸附柱，工作台中晾5min8、将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入50ul预热的ddH2O或者Elution Buffer，室温放置2min9、12000rpm离心2min，如果需要较多量

11、DNA，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，离心1分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于25l，体积过小降低DNA洗脱效率，减少产量。 七、双酶切pcr产物和质粒用BamHI和SacI分别双酶切pcr产物和质粒，内切酶为Thermo 公司双酶切体系如下：BamHI和SacI各2.5ul10T Buffer5ulPcr产物或质粒XulddH2OTo 50ulPcr产物1ug 质粒3ug反应条件3730min8010min1660min八、酶切产物回收若酶切产物小片段10000rpm离心8-10min7、将上清液转移至离心柱8、10000

12、rpm离心1min，弃废液9、加入500ul HBC ，10000rpm离心1min，弃废液10、加入700ul wash buffer ，10000rpm离心1min，弃废液11、加入500ul wash buffer ，10000rpm离心1min，弃废液12、10000rpm空柱离心3min 13、取出吸附柱，室温晾10min14、放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加15、100l洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70水浴中预热），室温放置3-5分钟，12,000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。16、DNA可以

13、存放在2-8,如果要长时间存放，可以放置在-20。十四、酶切验证Total 20ul质粒 1ugBuffer 2ul酶1 1ul酶2ddH2O1ulTo 20ul反应条件3730min8010min1660min琼脂糖凝胶电泳检测十五、转化感受态农杆菌1、将从超低温冰箱取出的感受态细胞置冰上融化2、每管感受态细胞加入10pg-10ng 待转化的DNA，轻柔混匀，于冰上静置20-30min。一般质粒加2-3ul，3、将离心管置于液氮中放置2min4、将离心管置于37水浴锅中孵育90-120s，取出后立即放冰上2-3min。5、加入600-1000ul不含抗生素的LB或SOC培养基，颠倒混匀。6、

14、于28摇床震荡培养3h，转速150-180rpm/min,不能超过220rpm7、取适量菌液（一般200ul）涂布至与目标质粒抗性一致的LB平板中，于28培养箱中倒置培养36-48h注意事项，涂布棒需要提前灭菌，一般是喷上酒精置于酒精灯上烧20-30s，待平板中菌液晾干后再用封口膜封好十六、单克隆检测方法同十一十七、侵染液配制试剂 200mlMs盐 0.866g蔗糖 10gPH 5.7 灭菌SilwetL-77 100ul 6-BA 1ul（母液2mg/ml）1、培养农杆菌，OD600=0.5-0.82、5000rpm 5min收集菌体3、倒上清，加等体积侵染液4、沾花法侵染30sec5、保湿、黑暗培养2天