常用载体构建说明书.docx
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常用载体构建说明书
常用载体构建说明书
步骤:
一、基本耗材准备(抗生素、LB液体培养基、LB固体培养基、离心管、枪头、三角瓶)
二、制备感受态大肠杆菌
三、设计引物
四、Pcr扩增
五、Pcr产物检测
六、Pcr产物回收
七、双酶切pcr产物和质粒
八、酶切产物回收
九、目的基因与载体连接
十、转化感受态大肠杆菌
十一、单克隆检测
十二、测序比对
十三、提质粒
十四、酶切验证
十五、转化感受态农杆菌
十六、单克隆检测
十七、侵染液配制
一、基本耗材准备
1、抗生素的制备(抗生素为索来宝公司)
常用抗生素Kan(卡那)Amp(氨苄)Rif(利福平)
母液浓度:
Kan50mg/mlAmp100mg/mlRif100mg/ml
工作浓度:
Kan50ng/ulAmp100ng/ulRif100ng/ul
举例:
称取kan固体1g于注射器中,加入20mlddH2O,溶解后用过滤器注入灭过菌的离心管中,-20度保存,使用比例1:
1000
注意:
Rif溶解时加入DMSO
2、培养基的配制
LB液体培养基
1000ml200ml
牛肉膏5g1g
蛋白胨10g2g
氯化钠10g2g
LB固体培养基
1000ml200ml
牛肉膏
蛋白胨
氯化钠
琼脂粉
5g
10g
10g
15g
1g
2g
2g
3g
120℃高温高压灭菌15-20min,固体培养基冷却后加入相应抗性,加入比例1:
1000,然后把培养基倒90cc的培养皿中,一般情况下一个培养皿可倒20ml培养基。
3、离心管、枪头、三角瓶
0.2ml、1.5ml、2.0ml离心管各200-500个,50ml离心管2个
10ul、200ul、1000ul枪头各2盒
50ml、100ml、250ml、500ml三角瓶各2个
去离子水或双蒸水500ml
二、制备感受态大肠杆菌(所用超级感受态细胞制备试剂盒购于上海生工)
BTMedia培养基制备:
1支BTMedia加50ml蒸馏水配制,放入250ml三角瓶,高压灭菌即可
准备工作:
将BTBufferA和BTBufferB放冰上遇冷,遇冷低温离心机至4℃
1、用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线,置37℃培养箱中静置培养12-16h待菌落生长到1-2mm大小。
2、挑取一个正常生长的菌落,接种至10-15ml液体LB培养基中,于37℃摇床充分震荡(>200rpm)培养2-16h。
3、将上述活化好的菌液0.5ml接种至准备好的50mlBTMedia中,于37℃摇床充分振荡培养至菌液OD600=0.5-0.6(注意监测菌液OD值,通常所需2-3h)。
4、将菌液至50ml离心管中,冰上放置5-10min。
5、于4℃,3500-5000rpm离心5min收集菌体沉淀。
6、每50ml培养物菌体沉淀用16ml冰上预冷的BTBufferA轻柔充分重悬菌体,冰上放置10-15min。
7、于4℃,3500-5000rpm离心2-5min收集菌体沉淀。
8、每50ml培养物菌体沉淀用4ml冰上预冷的BTBufferB轻柔充分重悬菌体,按每管100ul分装到冰上遇冷的1.5ml离心管中。
9、直接用于转化或用液氮冻后于超低温中保存。
三、设计引物
以CUB表达载体为骨架,cox2c为插入基因为例
1、分析插入区域可选酶切位点
载体可选酶切位点:
Eco53kI、SacI、XmaI、SmaI、BamHI
查看目的基因上是否含有上述酶切位点,以SacI为例,查找结果如下:
目的基因上没有SacI酶切位点,则SacI可作为候选的酶切位点之一。
同理,BamHI也可作为候选的酶切位点之一。
(同时这两个酶为常见酶,实验室有保存)因此,选取的酶切位点为SacI和BamHI,且BamHI在前,SacI在后。
2、查看保护碱基
在网页上搜索保护碱基表,
由于设计引物方向为5,到3,端,我们选的保护碱基为识别位点前黑色部分,及BamHI为cg或cgc,SacI为c
3、确定左右引物长度
根据Snapgeneview选取目的基因合适长度,
左引物组成:
保护碱基+酶切位点1+目的基因序列(ATG开始)
CgggatccATGATGATGATGACTAGATGGAGTTCC
利用Ssrhunter对选取目的基因序列反向互补
右引物组成:
保护碱基+酶切位点2+目的基因序列(终止密码子开始)
CgagctcTTAGTTGGTTTGGAGGATTAATTGATTGGAT
4、引物命名
为试验方便,一般引物命名为:
酶切位点+目的基因+左或右,这样可根据名称看出基因、酶切位点及左右引物
如:
BamHI-cox2c左CgggatccATGATGATGATGACTAGATGGAGTTCC
cox2c-SacI右CgagctcTTAGTTGGTTTGGAGGATTAATTGATTGGAT
四、用高保真酶进行pcr扩增
于灭菌pcr管中配制如下反应体系,一般设置两个重复
ddh2oTo50ul
2xPhantaMaxBuffer25ul
DntpMix(10mMeach)1ul
模板DNAXul
引物12ul
引物22ul
PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase1ul
模板DNA推荐使用量:
基因组DNA,50-400ng;质粒或病毒DNA,10pg-30ng;cDNA,1-5ul
反应体系
循环步骤
温度
时间
循环数
预变性
95℃
30sec/3min
1
变性
95℃
15sec
25-35
退火
56-72℃
15sec
延伸
72℃
30-60sec/kb
彻底延伸
72℃
5min
1
预变性时间:
质粒或病毒DNA30sec,基因组或cDNA3min
五、Pcr产物检测
10XTBE
称取1.0g琼脂糖放入250ml三角瓶中,加入100ml0.5XTBE,微波炉中加热煮沸2.5min,放入凉水冷却2-3min,待冷却后加入8滴EB,摇晃均匀后倒入胶槽,插上梳子,凝固后(10min左右),用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,一般点样量为5ul,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
(注意:
加样前要先记下加样的顺序),电压150-200V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。
电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低,当Marker移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳。
在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带。
采用凝胶成像系统拍照保存。
六、Pcr产物回收
1、提前在65-70℃预热ddH2O或者ElutionBuffer
2、将有目的条带的剩余pcr产物收集至1.5ml灭菌离心管中,以1:
5体积比加入pcr产物结合液CP
3、将上述混合液混匀后转移到吸附柱中,室温放置1min,12000rpm离心40-60sec,倒掉收集管中的废液
4、加入700ulwashbuffer,12000rpm离心40-60sec,倒掉收集管中的废液
5、加入500ulwashbuffer,12000rpm离心40-60sec,倒掉收集管中的废液
6、12000rpm空柱离心3min
7、取出吸附柱,工作台中晾5min
8、将吸附柱放入一个干净的离心管中,加入50ul预热的ddH2O或者ElutionBuffer,室温放置2min
9、12000rpm离心2min,如果需要较多量DNA,可将得到的溶液重新加入吸附柱中,离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于25μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少产量。
七、双酶切pcr产物和质粒
用BamHI和SacI分别双酶切pcr产物和质粒,内切酶为Thermo公司
双酶切体系如下:
BamHI和SacI
各2.5ul
10×TBuffer
5ul
Pcr产物或质粒
Xul
ddH2O
To50ul
Pcr产物1ug质粒3ug
反应条件
37℃
30min
80℃
10min
16℃
60min
八、酶切产物回收
若酶切产物小片段<50bp可直接用纯化回收试剂盒直接回收,方法如六。
若酶切产物较大,则需切胶回收。
1、制备大孔胶
2、点样
3、在长波紫外灯下,用干净刀片将所需目的片段割下,尽量切除不含DNA的凝胶,得到凝胶体积越小越好。
4、将切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管,称重。
先称一个空1.5ml离心管重量,然后放入凝胶块后再称一次,两次重量相减,得到凝胶的重量。
5、加5倍体积溶胶液CP,如果凝胶浓度大于2%,应加入6-10倍体积溶胶液
6、56℃水浴放置10分钟(或直至胶完全溶解)。
每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。
7、将上一步所得溶液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中),室温放置1分钟,12000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。
如果总体积超过750μl,可分两次将溶液加入同一个吸附柱中。
8、加入700μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心40-60秒,弃掉废液。
9、加入500μl漂洗液WB,12000rpm离心40-60秒,弃掉废液。
10、将吸附柱EC放回空收集管中,12000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11、取出吸附柱,工作台中晾5min
12、将吸附柱放入一个干净的离心管中,加入50ul预热的ddH2O或者ElutionBuffer,室温放置2min
13、12000rpm离心2min,如果需要较多量DNA,可将得到的溶液重新加入吸附柱中,离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于25μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少产量。
九、目的基因与载体连接
T4连接酶为Thermo公司
连接体系如下
Totalvolume20ul
LinearvectorDNA200-100ng
插入片段1:
1to1:
5malarratioovervector
10xT4DNAligasebuffer2ul
T4DNALigase1ul
Water,nuclease-freeTo20ul
22℃连接20-30min,若不及时转化,可放-20℃保存
连好之后,可直接进行转化,从转化到涂板结束需要1个半小时,单克隆37℃生长12-16个小时可进行检测。
一般转化时间是下午3点以后到9点之间,第二天上午即可进行菌落pcr检测,琼脂糖凝胶电泳确认目的条带大小正确后即可送样测序。
十、转化感受态大肠杆菌
连接好的反应体系不用纯化回收,直接转化感受态大肠杆菌,转化前10min左右打开水浴锅,将温度设置为42℃,转化步骤如下:
1、将从超低温冰箱取出的感受态细胞置冰上融化
2、每管感受态细胞加入10pg-10ng待转化的DNA或连接产物,轻柔混匀,于冰上静置20-30min。
一般质粒加1ul,连接产物加5-10ul,加入体积不超过感受态细胞总体积的5%
3、将离心管置于42℃水浴锅中孵育45-90s,取出后立即放冰上2-3min。
4、加入600-1000ul不含抗生素的LB或SOC培养基,颠倒混匀。
5、于37℃摇床震荡培养45-60min,转速150-180rpm/min,不能超过220rpm
6、取适量菌液(一般200ul)涂布至与目标质粒抗性一致的LB平板中,于37℃培养箱中倒置培养12-16h
注意事项,涂布棒需要提前灭菌,一般是喷上酒精置于酒精灯上烧20-30s,待平板中菌液晾干后再用封口膜封好
十一、单克隆检测
1、清理工作台,灭菌。
准备pcr板、mix、灭菌ddH2O、检测引物、抗生素、枪头等。
检测引物可用载体通用引物也可用目的基因对应的pcr引物
2、往pcr板中每个孔加入10ulddH2O
3、用10ul枪头轻挑单克隆,把枪头放入加过ddH2O的pcr孔中
4、往培养基中加入相应的抗生素
5、把加过抗生素的培养基分装到1.5ml离心管中,一个离心管加600-1000ul培养基
6、把移液枪调到8ul,把放入10ulddH2O中的菌落吸打混匀后吸出8ul放入加过培养基的1.5ml离心管,并在管上标注,每挑完一板用报纸封好,置于37℃摇床震荡培养
7、在1.5ml离心管中配制pcr反应体系
ddH2O
3.8-4.0ul
引物1
0.2ul
引物2
0.2ul
Mix
5ul
根据所挑单克隆个数,体系放大,一般设2个空白对照
Pcr扩增程序如下反应体系
循环步骤
温度
时间
循环数
预变性
95℃
3min
1
变性
95℃
30sec
8
退火
65℃-1℃
30sec
延伸
72℃
30-60sec/kb
变性
95℃
30sec
28
退火
58℃
30sec
延伸
72℃
30-60sec/kb
彻底延伸
72℃
5min
1
8、琼脂糖凝胶电泳检测
9、挑出检测出目的条带的单克隆菌液,在工作台中吸出300-500ul到一新的1.5ml离心管中,一般测3-5个样
十二、测序比对
以DNAMAN比对软件为例
1、下载测序结果
2、把拼接序列和参考序列以文本格式整理到一个文件夹中
3、打开DNANAN
4、依次打开序列---比对---多序列比对---文件夹,找到对应的文件夹打开
5、点下一步---快速比对---下一步---完成
十三、提质粒
1、取2-5毫升培养菌液(最多不超过2x109个细胞),10,000rpm,离心1min,弃上清,收集菌体,尽可能的吸净上清。
起始处理量可以根据细菌密度,细胞种类,预期产量进行调整,但是离心吸附柱最大吸附能力25μg基因组DNA,如果菌体过量超过最大吸附能力,反而会严重降低产量。
2、加入250μlsolutionⅠ重悬细胞
3、将菌液转移至一个新的1.5ml离心管
4、加入250ulsolutionⅡ,轻柔混匀
5、加入350ulsolutionⅢ,立即颠倒混匀
6、>10000rpm离心8-10min
7、将上清液转移至离心柱
8、>10000rpm离心1min,弃废液
9、加入500ulHBC,>10000rpm离心1min,弃废液
10、加入700ulwashbuffer,>10000rpm离心1min,弃废液
11、加入500ulwashbuffer,>10000rpm离心1min,弃废液
12、>10000rpm空柱离心3min
13、取出吸附柱,室温晾10min
14、放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加
15、100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热), 室温放置3-5分钟,12,000 rpm 离心1分钟。
将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000 rpm离心1分钟。
16、 DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
十四、酶切验证
Total20ul
质粒1ug
Buffer2ul
酶11ul
酶2
ddH2O
1ul
To20ul
反应条件
37℃
30min
80℃
10min
16℃
60min
琼脂糖凝胶电泳检测
十五、转化感受态农杆菌
1、将从超低温冰箱取出的感受态细胞置冰上融化
2、每管感受态细胞加入10pg-10ng待转化的DNA,轻柔混匀,于冰上静置20-30min。
一般质粒加2-3ul,
3、将离心管置于液氮中放置2min
4、将离心管置于37℃水浴锅中孵育90-120s,取出后立即放冰上2-3min。
5、加入600-1000ul不含抗生素的LB或SOC培养基,颠倒混匀。
6、于28℃摇床震荡培养3h,转速150-180rpm/min,不能超过220rpm
7、取适量菌液(一般200ul)涂布至与目标质粒抗性一致的LB平板中,于28℃培养箱中倒置培养36-48h
注意事项,涂布棒需要提前灭菌,一般是喷上酒精置于酒精灯上烧20-30s,待平板中菌液晾干后再用封口膜封好
十六、单克隆检测
方法同十一
十七、侵染液配制
试剂200ml
Ms盐0.866g
蔗糖10g
PH5.7
灭菌
SilwetL-77100ul
6-BA1ul(母液2mg/ml)
1、培养农杆菌,OD600=0.5-0.8
2、5000rpm5min收集菌体
3、倒上清,加等体积侵染液
4、沾花法侵染30sec
5、保湿、黑暗培养2天