常用载体构建说明书.docx
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常用载体构建说明书
常用载体构建说明书
步骤：
一、基本耗材准备（抗生素、LB液体培养基、LB固体培养基、离心管、枪头、三角瓶）
二、制备感受态大肠杆菌
三、设计引物
四、Pcr扩增
五、Pcr产物检测
六、Pcr产物回收
七、双酶切pcr产物和质粒
八、酶切产物回收
九、目的基因与载体连接
十、转化感受态大肠杆菌
十一、单克隆检测
十二、测序比对
十三、提质粒
十四、酶切验证
十五、转化感受态农杆菌
十六、单克隆检测
十七、侵染液配制
一、基本耗材准备
1、抗生素的制备（抗生素为索来宝公司）
常用抗生素Kan（卡那）Amp（氨苄）Rif（利福平）
母液浓度：
Kan50mg/mlAmp100mg/mlRif100mg/ml
工作浓度：
Kan50ng/ulAmp100ng/ulRif100ng/ul
举例：
称取kan固体1g于注射器中，加入20mlddH2O，溶解后用过滤器注入灭过菌的离心管中，-20度保存，使用比例1:
1000
注意：
Rif溶解时加入DMSO
2、培养基的配制
LB液体培养基
1000ml200ml
牛肉膏5g1g
蛋白胨10g2g
氯化钠10g2g
LB固体培养基
1000ml200ml
牛肉膏
蛋白胨
氯化钠
琼脂粉
5g
10g
10g
15g
1g
2g
2g
3g
120℃高温高压灭菌15-20min，固体培养基冷却后加入相应抗性，加入比例1:
1000，然后把培养基倒90cc的培养皿中，一般情况下一个培养皿可倒20ml培养基。
3、离心管、枪头、三角瓶
0.2ml、1.5ml、2.0ml离心管各200-500个，50ml离心管2个
10ul、200ul、1000ul枪头各2盒
50ml、100ml、250ml、500ml三角瓶各2个
去离子水或双蒸水500ml
二、制备感受态大肠杆菌（所用超级感受态细胞制备试剂盒购于上海生工）
BTMedia培养基制备：
1支BTMedia加50ml蒸馏水配制，放入250ml三角瓶，高压灭菌即可
准备工作：
将BTBufferA和BTBufferB放冰上遇冷，遇冷低温离心机至4℃
1、用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线，置37℃培养箱中静置培养12-16h待菌落生长到1-2mm大小。
2、挑取一个正常生长的菌落，接种至10-15ml液体LB培养基中，于37℃摇床充分震荡（>200rpm）培养2-16h。
3、将上述活化好的菌液0.5ml接种至准备好的50mlBTMedia中，于37℃摇床充分振荡培养至菌液OD600=0.5-0.6（注意监测菌液OD值，通常所需2-3h）。
4、将菌液至50ml离心管中，冰上放置5-10min。
5、于4℃，3500-5000rpm离心5min收集菌体沉淀。
6、每50ml培养物菌体沉淀用16ml冰上预冷的BTBufferA轻柔充分重悬菌体，冰上放置10-15min。
7、于4℃，3500-5000rpm离心2-5min收集菌体沉淀。
8、每50ml培养物菌体沉淀用4ml冰上预冷的BTBufferB轻柔充分重悬菌体，按每管100ul分装到冰上遇冷的1.5ml离心管中。
9、直接用于转化或用液氮冻后于超低温中保存。
三、设计引物
以CUB表达载体为骨架，cox2c为插入基因为例
1、分析插入区域可选酶切位点
载体可选酶切位点:
Eco53kI、SacI、XmaI、SmaI、BamHI
查看目的基因上是否含有上述酶切位点，以SacI为例，查找结果如下：
目的基因上没有SacI酶切位点，则SacI可作为候选的酶切位点之一。
同理，BamHI也可作为候选的酶切位点之一。
（同时这两个酶为常见酶，实验室有保存）因此，选取的酶切位点为SacI和BamHI，且BamHI在前，SacI在后。
2、查看保护碱基
在网页上搜索保护碱基表，
由于设计引物方向为5，到3，端，我们选的保护碱基为识别位点前黑色部分，及BamHI为cg或cgc，SacI为c
3、确定左右引物长度
根据Snapgeneview选取目的基因合适长度，
左引物组成：
保护碱基+酶切位点1+目的基因序列（ATG开始）
CgggatccATGATGATGATGACTAGATGGAGTTCC
利用Ssrhunter对选取目的基因序列反向互补
右引物组成：
保护碱基+酶切位点2+目的基因序列（终止密码子开始）
CgagctcTTAGTTGGTTTGGAGGATTAATTGATTGGAT
4、引物命名
为试验方便，一般引物命名为：
酶切位点+目的基因+左或右，这样可根据名称看出基因、酶切位点及左右引物
如：
BamHI-cox2c左CgggatccATGATGATGATGACTAGATGGAGTTCC
cox2c-SacI右CgagctcTTAGTTGGTTTGGAGGATTAATTGATTGGAT
四、用高保真酶进行pcr扩增
于灭菌pcr管中配制如下反应体系，一般设置两个重复
ddh2oTo50ul
2xPhantaMaxBuffer25ul
DntpMix（10mMeach）1ul
模板DNAXul
引物12ul
引物22ul
PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase1ul
模板DNA推荐使用量：
基因组DNA，50-400ng；质粒或病毒DNA，10pg-30ng；cDNA，1-5ul
反应体系
循环步骤
温度
时间
循环数
预变性
95℃
30sec/3min
1
变性
95℃
15sec
25-35
退火
56-72℃
15sec
延伸
72℃
30-60sec/kb
彻底延伸
72℃
5min
1
预变性时间：
质粒或病毒DNA30sec，基因组或cDNA3min
五、Pcr产物检测
10XTBE
称取1.0g琼脂糖放入250ml三角瓶中，加入100ml0.5XTBE，微波炉中加热煮沸2.5min，放入凉水冷却2-3min，待冷却后加入8滴EB，摇晃均匀后倒入胶槽，插上梳子，凝固后（10min左右），用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，一般点样量为5ul，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
（注意:
加样前要先记下加样的顺序），电压150-200V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。
电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，当Marker移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带。
采用凝胶成像系统拍照保存。
六、Pcr产物回收
1、提前在65-70℃预热ddH2O或者ElutionBuffer
2、将有目的条带的剩余pcr产物收集至1.5ml灭菌离心管中，以1:
5体积比加入pcr产物结合液CP
3、将上述混合液混匀后转移到吸附柱中，室温放置1min，12000rpm离心40-60sec，倒掉收集管中的废液
4、加入700ulwashbuffer，12000rpm离心40-60sec，倒掉收集管中的废液
5、加入500ulwashbuffer，12000rpm离心40-60sec，倒掉收集管中的废液
6、12000rpm空柱离心3min
7、取出吸附柱，工作台中晾5min
8、将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入50ul预热的ddH2O或者ElutionBuffer，室温放置2min
9、12000rpm离心2min，如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于25μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少产量。
七、双酶切pcr产物和质粒
用BamHI和SacI分别双酶切pcr产物和质粒，内切酶为Thermo公司
双酶切体系如下：
BamHI和SacI
各2.5ul
10×TBuffer
5ul
Pcr产物或质粒
Xul
ddH2O
To50ul
Pcr产物1ug质粒3ug
反应条件
37℃
30min
80℃
10min
16℃
60min
八、酶切产物回收
若酶切产物小片段<50bp可直接用纯化回收试剂盒直接回收，方法如六。
若酶切产物较大，则需切胶回收。
1、制备大孔胶
2、点样
3、在长波紫外灯下，用干净刀片将所需目的片段割下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。
4、将切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，称重。
先称一个空1.5ml离心管重量，然后放入凝胶块后再称一次，两次重量相减，得到凝胶的重量。
5、加5倍体积溶胶液CP，如果凝胶浓度大于2％，应加入6-10倍体积溶胶液
6、56℃水浴放置10分钟（或直至胶完全溶解）。
每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。
7、将上一步所得溶液加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），室温放置1分钟，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
如果总体积超过750μl，可分两次将溶液加入同一个吸附柱中。
8、加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心40-60秒，弃掉废液。
9、加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心40-60秒，弃掉废液。
10、将吸附柱EC放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11、取出吸附柱，工作台中晾5min
12、将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入50ul预热的ddH2O或者ElutionBuffer，室温放置2min
13、12000rpm离心2min，如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于25μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少产量。
九、目的基因与载体连接
T4连接酶为Thermo公司
连接体系如下
Totalvolume20ul
LinearvectorDNA200-100ng
插入片段1:
1to1:
5malarratioovervector
10xT4DNAligasebuffer2ul
T4DNALigase1ul
Water，nuclease-freeTo20ul
22℃连接20-30min，若不及时转化，可放-20℃保存
连好之后，可直接进行转化，从转化到涂板结束需要1个半小时，单克隆37℃生长12-16个小时可进行检测。
一般转化时间是下午3点以后到9点之间，第二天上午即可进行菌落pcr检测，琼脂糖凝胶电泳确认目的条带大小正确后即可送样测序。
十、转化感受态大肠杆菌
连接好的反应体系不用纯化回收，直接转化感受态大肠杆菌，转化前10min左右打开水浴锅，将温度设置为42℃，转化步骤如下：
1、将从超低温冰箱取出的感受态细胞置冰上融化
2、每管感受态细胞加入10pg-10ng待转化的DNA或连接产物，轻柔混匀，于冰上静置20-30min。
一般质粒加1ul，连接产物加5-10ul，加入体积不超过感受态细胞总体积的5%
3、将离心管置于42℃水浴锅中孵育45-90s，取出后立即放冰上2-3min。
4、加入600-1000ul不含抗生素的LB或SOC培养基，颠倒混匀。
5、于37℃摇床震荡培养45-60min，转速150-180rpm/min,不能超过220rpm
6、取适量菌液（一般200ul）涂布至与目标质粒抗性一致的LB平板中，于37℃培养箱中倒置培养12-16h
注意事项，涂布棒需要提前灭菌，一般是喷上酒精置于酒精灯上烧20-30s，待平板中菌液晾干后再用封口膜封好
十一、单克隆检测
1、清理工作台，灭菌。
准备pcr板、mix、灭菌ddH2O、检测引物、抗生素、枪头等。
检测引物可用载体通用引物也可用目的基因对应的pcr引物
2、往pcr板中每个孔加入10ulddH2O
3、用10ul枪头轻挑单克隆，把枪头放入加过ddH2O的pcr孔中
4、往培养基中加入相应的抗生素
5、把加过抗生素的培养基分装到1.5ml离心管中，一个离心管加600-1000ul培养基
6、把移液枪调到8ul，把放入10ulddH2O中的菌落吸打混匀后吸出8ul放入加过培养基的1.5ml离心管，并在管上标注，每挑完一板用报纸封好，置于37℃摇床震荡培养
7、在1.5ml离心管中配制pcr反应体系
ddH2O
3.8-4.0ul
引物1
0.2ul
引物2
0.2ul
Mix
5ul
根据所挑单克隆个数，体系放大，一般设2个空白对照
Pcr扩增程序如下反应体系
循环步骤
温度
时间
循环数
预变性
95℃
3min
1
变性
95℃
30sec
8
退火
65℃-1℃
30sec
延伸
72℃
30-60sec/kb
变性
95℃
30sec
28
退火
58℃
30sec
延伸
72℃
30-60sec/kb
彻底延伸
72℃
5min
1
8、琼脂糖凝胶电泳检测
9、挑出检测出目的条带的单克隆菌液，在工作台中吸出300-500ul到一新的1.5ml离心管中，一般测3-5个样
十二、测序比对
以DNAMAN比对软件为例
1、下载测序结果
2、把拼接序列和参考序列以文本格式整理到一个文件夹中
3、打开DNANAN
4、依次打开序列---比对---多序列比对---文件夹，找到对应的文件夹打开
5、点下一步---快速比对---下一步---完成
十三、提质粒
1、取2-5毫升培养菌液（最多不超过2x109个细胞），10,000rpm，离心1min，弃上清，收集菌体，尽可能的吸净上清。
起始处理量可以根据细菌密度，细胞种类，预期产量进行调整，但是离心吸附柱最大吸附能力25μg基因组DNA，如果菌体过量超过最大吸附能力，反而会严重降低产量。
2、加入250μlsolutionⅠ重悬细胞
3、将菌液转移至一个新的1.5ml离心管
4、加入250ulsolutionⅡ，轻柔混匀
5、加入350ulsolutionⅢ，立即颠倒混匀
6、>10000rpm离心8-10min
7、将上清液转移至离心柱
8、>10000rpm离心1min，弃废液
9、加入500ulHBC，>10000rpm离心1min，弃废液
10、加入700ulwashbuffer，>10000rpm离心1min，弃废液
11、加入500ulwashbuffer，>10000rpm离心1min，弃废液
12、>10000rpm空柱离心3min
13、取出吸附柱，室温晾10min
14、放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加
15、100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热）， 室温放置3-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟。
16、 DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
十四、酶切验证
Total20ul
质粒1ug
Buffer2ul
酶11ul
酶2
ddH2O
1ul
To20ul
反应条件
37℃
30min
80℃
10min
16℃
60min
琼脂糖凝胶电泳检测
十五、转化感受态农杆菌
1、将从超低温冰箱取出的感受态细胞置冰上融化
2、每管感受态细胞加入10pg-10ng待转化的DNA，轻柔混匀，于冰上静置20-30min。
一般质粒加2-3ul，
3、将离心管置于液氮中放置2min
4、将离心管置于37℃水浴锅中孵育90-120s，取出后立即放冰上2-3min。
5、加入600-1000ul不含抗生素的LB或SOC培养基，颠倒混匀。
6、于28℃摇床震荡培养3h，转速150-180rpm/min,不能超过220rpm
7、取适量菌液（一般200ul）涂布至与目标质粒抗性一致的LB平板中，于28℃培养箱中倒置培养36-48h
注意事项，涂布棒需要提前灭菌，一般是喷上酒精置于酒精灯上烧20-30s，待平板中菌液晾干后再用封口膜封好
十六、单克隆检测
方法同十一
十七、侵染液配制
试剂200ml
Ms盐0.866g
蔗糖10g
PH5.7
灭菌
SilwetL-77100ul
6-BA1ul（母液2mg/ml）
1、培养农杆菌，OD600=0.5-0.8
2、5000rpm5min收集菌体
3、倒上清，加等体积侵染液
4、沾花法侵染30sec
5、保湿、黑暗培养2天
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