类风湿性关节炎滑膜淋巴细胞CD3CD4CD8的表达及意义参考模板.docx

1、类风湿性关节炎滑膜淋巴细胞CD3CD4CD8的表达及意义参考模板天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是由于自身免疫调节异常所导致 的关节炎症。它的基本病理改变为关节滑膜慢性炎症形成侵袭性血管翳，破坏 软骨、骨与周围组织。淋巴细胞浸润和渗出是其主要的病理特征，而T淋巴细 胞、B淋巴细胞、浆细胞及巨噬细胞是其主要的炎性细胞，其中淋巴细胞的浸 润和渗出是以T淋巴细胞为主。CD3是比较特异的T细胞抗体，表达于所有T 细胞表面；CD4+T细胞具有辅助、诱导细胞及体液免疫的作用；CD8+细胞具有 细胞毒效应，也发挥抑制细胞及体液免疫的作用。

2、CD4CD8比例失衡可导致多 种自身免疫性疾病。本研究通过检测类风湿性关节炎患者滑膜组织中淋巴细胞 CD3、CD4、CD8的表达及分布状况，探讨其在RA发病中的作用。方法：收集天津市天津医院病理科2009年1月至2011年10月经病理学确诊为RA 的手术切除滑膜组织标本40例。另外选取10例骨性关节炎(OA)滑膜组织作 为对照组。选取的组织蜡块做4pm的连续切片，采用免疫组织化学方法，分别检测RA组及OA组中多克隆兔抗人CD3抗体、小鼠抗人CD4单抗、小鼠抗人CD8单抗的表达状况。采用SPSSl60统计软件包对数据进行分析。计量资料用 (iS)表示，数据比较用配对或独立样本t检验，显著性检验水

3、准a值规定为 O05。结果：1所有RA病例的滑膜组织中均显示中等量或大量淋巴细胞浸润，925 (3740)的病例出现淋巴细胞灶性聚集，甚至出现生发中心，形成淋巴滤泡 样结构。CD3在RA滑膜组织中高表达，而在OA滑膜组织中低表达，CD3+ 淋巴细胞在RA组中数量显著高于OA组，差异具有统计学意义，(P005)； 浸润的淋巴细胞中CD3表达阳性的淋巴细胞约占淋巴细胞总数的72；2CD4在RA滑膜组织中高表达，而在OA滑膜组织中低表达，CD4+淋巴细胞 在RA组中数量显著高于OA组，差异具有统计学意义(P005)；3CD8在RA滑膜组织中高表达，而在OA滑膜组织中低表达，CD8+淋巴细胞天津医科大

4、学硕士学位论文在RA组中数量显著高于OA组，差异具有统计学意义(P005)； 4在RA组病例中，浸润的淋巴细胞中CD4+T淋巴细胞占多数，多呈灶性分布，而CD8+T淋巴细胞数量较少，散在分布于滑膜组织中，CD8+T淋巴细胞的 阳性表达数量明显低于CD4+T淋巴细胞，差异具有统计学意义(P005)；5在OA组病例中，CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞数量都较RA组少，RA 组与OA组相比，CD4CD8比值升高，差异具有统计学意义(P005)。结论：1所有RA病例的滑膜组织中均显示中等量或大量淋巴细胞浸润，浸润的淋巴 细胞中大多数表达CD3，约占淋巴细胞总数的72，CD3在RA组的表达显 著高

5、于OA组，证明T淋巴细胞在RA的发病中发挥了重要作用；2CD4+T淋巴细胞在RA组中的表达率高于OA组，提示CD4的高表达可能 促进RA的发生和发展，在RA的发病中起重要作用；3CD8+T淋巴细胞在RA组中的表达率高于OA组，提示CD8的高表达可能 在RA的发病中发挥一定的作用；4RA病例的滑膜组织中CD8+T淋巴细胞的表达数量明显低于CD4+T淋巴细 胞，其表达的降低表明其保护性作用的降低从而导致RA患者的免疫性亢进， 提示CD8+T淋巴细胞在RA的发病中似乎发挥了保护性作用。5RA组与OA组比，CD4+CD8+Izk,值升高，从而从损伤组织的蛋白水平证明 CD4+CD8+失衡对类风湿性关节

6、炎的发病产生了一定的影响，CD4+CD8+ 比值可能作为类风湿性关节炎诊断及预后估计的参考指标。关键词：类风湿性关节炎CD3 CD4 CD8 CD4+CD8+免疫组织化学AbstractObject i ve：Rheumatoid arthritis is an arthritis inflammation which caused bv abnonnal adjustment of autoimmunityThe Fundamental pathological change is the joint synovial chronic inflammation leading to form

7、ation of pannus，which destroyS cartilage，bone and surrounding tissuesIt shows that the infiltration and exudation oflymphocyte is the key factor in rheumatoid arthritisMany kinds of immune cellsparticipate in the autoimmune inflammation，in which mainly including W，Blymphocyte，plasma cells and macrop

8、hages，and T lymphocyte is dominatedCD3 is a special T cells antibody which expressed on all T cell surface；CD4+T are T helper cells which could help or induce cell and humoral immune otherwise CD8+T aresuppressor cells which could suppress or inhibit cell and humoral immuneThe imbalance of CD4CD8 ca

9、ll lead to a variety of autoimmune diseasesIn order to research the effection of CD3，CD4 and CD8 in rheumatoid arthritis，we detected their expression and distribution in synoviumMater i a l s and methods：We collected 40 cases formalin-fixed，paraffinembedded synovium tissues of RA patients during Jan

10、uary 2009 to October 201 0 in Tianjin hospitalWe also selected 1 0 cases of osteoarthritis(OA)synovium as the control groupThe tissuesware section thicked 4amWe examinated the expression of the antibodies ofCD3，CD4 and CD8 in rheumatoid arthritis synovium and osteoarthritis synovium with immunohisto

11、chemistry EnVision method(The datas were analyzed bv i士s and compared with independentsamples T test and pairedsamples T test by SPSS l 6O)Statistical significance was defined as P005Resu l ts：1All of the RA cases showed a large number of lymphocytes infiltration in the synovium，925(3740)cases showe

12、d lymphocytesfocal gmheringeven appearing germinal center and forming lymphatic follicular sample structureThe CD3 expression rate in RA patients was obviously highelthan OA group(PO05)Thepositive expression of CD3 accounts for about 72of the total number oflymphocytes11I2The CD4 positive expression

13、 rate in RA patients was obviously higher than OAgroup(P005)：3The CD8 positive expression rate in RA patients was obviously higher than OAgroup(P005)；4The majority infiltration in the RA group were CD4+T lyrnphocytes and their distribution were focal gathered，otherwise the quantity of CD8+T lymphocy

14、tes were fewer and were scattered in synovial organizationThe CD8 positive expression rate in RA patients was obviously higher than CD4(P005)5The quantity of CD4 and CD8 positive T lymphocytes in OA group were fewer than that of RA group，The rate of CD4CD8 of RA group was obviously higher thanOA gro

15、up(PO05)Conc I US i on：1All of the RA cases showed a large number of lymphocytes infiltration in the synovium and most of them were CD3 positive which is about 72Meanwhile the majority of them is CD4+T lymphocytes and the minority is CD8+T lymphocytes in the RA groupAround the focal gathered lymphoc

16、ytes，there are plasma cells；2The CD4 positive expression rate in RA patients was obviously higher than OAgroup，CD4 may play an important role in the RA pathogenesis；3The CD8 positive expression rate in RA patients was obviously higher than OAgroup，CD8 may play an important role in the RA pathogenesi

17、s；4The CD8 positive expression rate in RA patients was obviously lower than CD4which may decrease the protection of CD8 and led to the hyperfunction of immune，CD8 may play an protection role in the RA pathogenesis；5The rate of CD4+CD8+of RA group is higher than OA group，which shows that the imbalanc

18、e of CD4+CDS+may play a role in RA，the rate of CD4+CD8+may play a role orl the diagnosis of RA and can be a reference in prognosis evaluationKeywor ds： Rheumatoid arthritis CD3 CD4 CD8 CD4+CD8+immunohistochemistry天津医科大学硕士学位论文缩略语RA rheumatoid arthritis 类风湿性关节炎SCW streptococcal cell wall fragments 链球菌

19、细胞壁成分诱导的关节炎CL collagen induced arthritis 胶原诱导的关节炎OA osteoarthritis 骨性关节炎DAB 3,3-diaminobenzidine 二氨基联苯胺PBS phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲液 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 IHC immunohistochemistry 免疫组织化学 MHC major histocompatibility complex 组织相容性复合体 HLA human leucocyte antigen 人类白细胞抗

20、原乃 T helper cells T辅助细胞Ts T suppressor cells T抑制细胞TCR T cell receptor T细胞受体ITAM Immunoreceptor tyrosinebased activation免疫受体酪氨酸活化基序motifcDNA complementary DNA 互补DNACTL cytotoxic T lymphocyte 杀伤性T淋巴细胞TNFQ tumor necrosis factorQ 肿瘤坏死因子QIFNY interferonY 干扰素YSCID severe combined immunodeficient 严重联合免疫缺陷天

21、津医科大学硕士学位论文t_J一刖吾研究现状、成果类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是由于自身免疫调节异常所导致 的关节慢性炎症性疾病。它的基本病理改变为关节滑膜慢性炎症形成侵袭性血 管翳，破坏软骨、骨与周围组织。淋巴细胞浸润和渗出是其主要的病理特征， 而T淋巴细胞、B淋巴细胞、浆细胞及巨噬细胞是其主要的炎性淋巴细胞，其 中淋巴细胞的浸润和渗出是以T淋巴细胞为主【l】。CD3是比较特异的T细胞抗体，表达于所有T细胞表面，参与T细胞的信 号转导。主要用于标记胸腺细胞、T淋巴细胞及T细胞淋巴瘤。在类风湿性关 节炎中，聚集的淋巴细胞大多数表达CD3。近年来，CD4+T细胞

22、在自身免疫性疾病中所造成的组织破坏和器官损伤， 以及其对于入侵的有害物质所产生保护性的免疫机制已经基本阐明。激活的 CD4+T细胞在控制和推动初始的特异性免疫应答的过程中发挥极其重要的作 用。一旦被激活，CD4+T细胞即分化成特殊的效应细胞，并成为特异性免疫应 答中主要的调节因子。大量的研究显示【2】，CD4+T细胞在RA中发挥重要的作用， 这与CD4+T细胞在疾病的免疫发病机制中发挥主导作用的假设相一致。研究发 现在类风湿性关节炎患者的末梢血及其滑液中可以检测到激活的CD4+T细胞【3】。CD4+T细胞在实验性关节炎症的动物模型中发挥重要作用，可以导致自身 免疫性的关节损伤【41。此外，基于

23、T细胞的靶向治疗已经在临床证实有显著的疗 效【51。虽然CD8+T细胞是免疫系统主要的效应细胞，但其在自身免疫性疾病中所 发挥的作用还很少被关注。CD8+T细胞已被证实在几种自身免疫性疾病动物实 验模型，如糖尿病、多发性硬化症及重症肌无力【6】中具有至关重要的作用。然 而CD8+T细胞在RA动物模型中的作用存在争议。在SCW的大鼠模型中，CD8+T 细胞缺乏的大鼠产生了早期诱导RA的发病作用及其病程的延长【9】。另一方面， 在使用CIA的模型研究中发现，在CD8+T细胞缺乏的老鼠并没有表现出对于 RA产生的诱导或加重疾病的作用【10】，提示CD8+T细胞在RA的病理机制中不是 很重要。然而，消

24、除CD8+T细胞的小鼠只有在他们初始免疫的两周之后对疾病 产生影响，而不是在免疫的同时产生影响。这表明CD8+T细胞可能在疾病的效天津医科大学硕士学位论文应阶段发挥重要的作用，而不是在RA发病的初始阶段发挥作用。CD8+T细胞在 RA中的发病作用还有待进一步研究。CD4+细胞具有辅助、诱导细胞免疫及体液免疫的作用；CD8+细胞具有细 胞毒效应，也发挥抑制细胞及体液免疫的作用。CD4CD8比例的失衡可导致多 种自身免疫性疾病。有研究表明T细胞【121，尤其是CD4+T细胞在RA的发病 机制中有重要作用，T细胞对未知抗原产生应答而活化，引发炎症介质的连锁 释放，激活了炎症因子网络，从而造成RA关节

25、的炎症反应【13】。CD4+CD8+L匕 例失衡与RA的发病密切相关。研究目的、方法本文采用免疫组织化学方法，检测滑膜组织中CD3、CD4、CD8阳性淋巴 细胞的表达及分布状况，探讨其在RA发病中的作用。收集天津市天津医院2009年1月至2011年10月经病理学确诊的RA病例 手术切除滑膜组织蜡块标本40例，由两名资深骨关节病理专家重新复查原始切 片诊断。其中女性31例，男性9例；年龄范围2274岁，平均年龄5535岁； 病变部位：膝关节33例，肘关节2例，腕关节2例，髋关节2例，踝关节1例。 另外选取10例骨性关节炎(OA)滑膜组织，年龄43-一68岁，作为对照组。切 片脱蜡，水化，热修复，

26、采用免疫组化EnVision法染色，DAB显色。用淋巴结 做阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。CD3的阳性产物呈棕色细颗粒状，主 要定位于淋巴细胞的细胞膜，少许细胞浆中亦可见表达。CD4、CD8的阳性产 物呈棕色细颗粒状，主要定位于淋巴细胞的细胞膜。每例随机选取10个高倍视 野，计数每个视野网格测微尺内阳性细胞个数，10个视野阳性细胞总数10得出 每例阳性细胞均数，每例CD4阳性细胞均数每例CD8阳性细胞均数得出每例 CD4+CD8+比值。采用SPSSl60统计软件包进行分析。计量资料用(夏)S 表示，数据比较用配对或独立样本t检验，CD4、CD8的相关性分析采用Pearson 相关，显著性

27、检验水准仅值规定为005。天津医科大学硕士学位论文1对象和方法11标本的来源111实验组收集天津市天津医院病理科2009年1月至2011年10月间手术切除并经病 理学确诊的类风湿性关节炎石蜡包埋标本，由两名资深骨关节病理专家重新复 查切片，参考Gb科诊断病理学【141筛选出实验组标本40例。其中女性31例， 男性9例；年龄范围2274岁，平均年龄5535岁；病变部位：膝关节33例， 肘关节2例，腕关节2例，髋关节2例，踝关节1例。112对照组选取同期骨性关节炎(OA)滑膜组织10例，其中女性8例，男性2例，年 龄4368岁，平均年龄5850岁，作为对照组。12实验仪器及主要化学试剂121主要实

28、验仪器 (1)全自动脱水机，型号：爱华TSJ一1A，产地：天津； (2)石蜡组织切片机，型号：Leica2235，产地：德国； (3)展片机，型号：爱华ZPJ1，产地：天津； (4)烤片机，型号：爱华KPJ1，产地：天津； (5)光学显微镜，型号：OLYMPUS，产地：日本； (6)病理显微图像分析系统，中科院空海公司，产地：北京； (7)万用电炉，型号：DK98II型，产地：天津； (8)微量移液器，型号：Gilson，产地：法国； (9)冰箱，型号：Hai*BCD256KT，产地：青岛。 122主要化学试剂(1)一抗：多克隆兔抗人CD3(Monoclonal Antibody Rabbit

29、 AntiHuman CD3)购自基 因科技(上海)有限公司：单克隆小鼠抗人CD4(Monoclonal Antibody Mouse AntiHuman CD4)购自 基因科技(上海)有限公司；单克隆小鼠抗人CD8(Monoclonal Antibody Mouse AntiHuman CD8)购自 基因科技(上海)有限公司。天津医科大学硕士学位论文(2)二步法抗兔鼠通用型免疫组化检测ChemMate俐EnVision+HRPDAB试剂 盒购自基因科技(上海)有限公司。表1 免疫组织化学第一抗体(标记物)相关参数(3)羊血清购自基因科技(上海)有限公司。 (4)抗体稀释液购自基因科技(上海)

30、有限公司。 (5)二步法抗兔鼠通用型免疫组化检测试剂盒(GK50070510)购白基因科技(上海)有限公司(包括试剂A：ChemMate。MEnsion+HPR，兔d,鼠、试 剂B：DAB缓冲稀释液、试剂C：DAB原液)，避光保存，即用即配。(6)APES购自北京中杉生物技术有限公司。 (7)丙酮为天津市化学试剂公司产品。 (8)PBS磷酸盐缓冲液(001M，PH7274)购自北京中杉生物技术有限公司。 (9)高PH值抗原修复液EDTA(100ml，PH9O)购自基因科技(上海)有限 公司。(10)无水乙醇为天津市化学试剂公司产品。 123主要溶液的配制：PBS(产品编号ZLI一9062)工作

31、液配制：每袋PBS粉剂加2000ml蒸馏水溶解配成溶液。 高PH值抗原修复液EDTA(产品编号GTl00410) 工作液配制：取l份抗原修复液(20x)和19份双蒸水，充分混匀后制成 抗原修复工作液。DAB显色液：(产品编号GK50070510) 工作液配制：实验前，按每毫升B液(DAB稀释液)中加1滴(或20微 升)C液(DAB原液)的浓度配制所需要的用量，充分混匀，即用即配。天津医科大学硕士学位论文APES：(产品编号ZLI一9001) 工作液配制：1mlAPES混合50ml丙酮，配得2APES丙酮溶液。13方法131切片准备 (1)将常规免疫组化所用载玻片先用清洁液除去油脂污物，在酸洗液中浸泡24 小时，捞出后经自来水反复冲洗，蒸馏水冲洗3次，烤箱80烤干； (2)洁净载玻片置入APES丙酮稀释液(1：50)中20-30秒取出稍停，再入纯丙酮中蘸洗3次，洗去未结合的APES； (3)自然晾干，装盒备用(注意防尘)； (4)盖玻片在酸洗液中浸泡6小时，蒸馏水反复冲洗，无水乙醇冲洗1次，自然晾干装盒备用(注意防尘)。 132标本的制备与储存全部标本均经1