论文定稿曾艳红.docx

1、论文定稿曾艳红免疫组织化学方法测定胰腺中胰岛细胞重庆工商大学 生物工程 09级 生物班 曾燕红指导教师 殷菲摘要：2 型糖尿病主要发生于成年人,是一种常见的代谢性疾病，其主要的特点是胰岛素抵抗和胰腺细胞功能下降或数量减少导致胰岛素分泌不足，是具有明显异质性的多因素、多基因遗传病,环境因素和遗传因素的共同作用促进了糖尿病的发生。由于胰腺细胞在胰腺细胞中的比例很低，观察和定位胰腺细胞是考察一些药物对细胞数量和活力的影响具有十分重要的作用，本文利用免疫组织化学方法测定胰腺中胰岛细胞。通过多实验条件和方法的反复摸索，我们成功的用免疫组化方法观察到胰岛细胞，并用双标的方法进行了确定。关键词：2型糖尿病，

2、胰腺细胞，免疫组织化学 Abstract: Type 2 diabetes mellitus occurs mainly in adults and is a metabolic disorder that is characterized by high blood glucose in the context of insulin resistance and relative insulin deficiency caused by decrease of pancreatic cells mass or the increase of cells apoptosis. Type 2 d

3、iabetes is a significant heterogeneity of multi-factor, multi-gene genetic diseases, environmental factors and genetic factors together contributed to the occurrence of diabetes. because the ratio of beta cell is really low in pancreatic cells, which is around 1%, so observation and identification i

4、s very important to revalue the effect of some compounds on pancreatic cells. In this study, we constructed a useful method to observe the pancreatic beta cells with immunohistochemistry staining. After tried again and again, we found pancreatic beta cells, which were made sure by double-staining wi

5、th DAPI and antibody for insulin. We also analyzed the factors that interrupted this experiment. Key words: Type 2 diabetes mellitus; pancreatic beta cells; Immunohistochemistry目录1前言 31.1 2型糖尿病的概述 31.1.1 2型糖尿病的发病人群 31.1.2 2型糖尿病的发病机制 31.2 2型糖尿病的研究进展 31.2.12型糖尿病的遗传学研究 31.2.2 2型糖尿病的治疗研究新进展 41.3 2型糖尿病的其

6、他治疗方法 61.4胰岛细胞的研究 61.4.1胰岛细胞功能评价的方法 61.4.2胰岛细胞功能评价的相关指数 71.4.3用于评估胰岛素敏感性的相关指数 81.5 本课题研究的主要内容 92实验部分 92.1 主要材料 92.1.1 实验动物 92.1.2 实验药品及试剂 92.1.3实验仪器和设备 102.2 实验原理 102.2.1 免疫组化概念 102.2.2 免疫组化实验所用的组织和细胞标本 112.2.3免疫组化实验所用的抗体 112.2.4免疫组化实验常用的染色方法 112.3 常用试剂的配制 112.3.1 浓缩缓冲液TBS的配制（10） 112.3.2多聚甲醛（PFA）的配制

7、 122.3.3 DAPI 的配制 122.4 免疫组化实验操作步骤 133 实验结果与讨论 133.1实验结果 133.2讨论 184结论与展望 184.1结论 184.2 展望 19参考文献 19致谢 211前言1.1 2型糖尿病的概述1.1.1 2型糖尿病的发病人群2型糖尿病可发生在任何年龄，但多见于40岁以上的成年人并且2型糖尿病占糖尿病的95%以上。2型糖尿病发病时其表现大致为多数体型肥胖或体重超重，其起病缓慢且糖尿病的典型症状“三多一少”比1型糖尿病要轻。在诊断2型糖尿病时，常常会发现患者存在血管并发症，而通常有此表现的患者可能已有510年的病程。在这期间2型糖尿病病人可以通过口服

8、降糖药降糖，因为他们体内的胰腺细胞还存在一定的功能。所以在没有特殊情况患者不需要进行胰岛素治疗，但是少数患者在口服降糖药效果不佳的情况下就需要进行胰岛素治疗了。2型糖尿病的主要病理生理改变了以胰岛素抵抗为主伴随胰岛素分泌不足到以胰岛素分泌不足为主伴随胰岛素抵抗。1.1.2 2型糖尿病的发病机制2型糖尿病的病因和发病机制是非常复杂的，因此，虽然科研人员和医学工作者一直不断致力于糖尿病的研究，但至今还没有完全阐明清楚其发病病因和发病机制。糖尿病并非是一种由单一病因而引发的疾病，它是由多种复合病因共同引起的综合征，这其中的病因包括遗传因素和环境因素在内的多种因素，其中遗传因素和环境因素起到非常重要的

9、作用。经过多年的研究，大致确定了2型糖尿病的发病机制，其中最能被大家认可的有以下四个因素：（1）肝糖生成增加；（2）肌肉葡萄糖摄取减少引发的胰岛素抵抗；（3）胰岛细胞功能受损；（4）脂肪组织存在胰岛素抵抗，使脂肪细胞的脂解作用增强，游离脂肪酸释放入血增多。1.2 2型糖尿病的研究进展1.2.1 2型糖尿病的遗传学研究近几年，随着人们生活水平的不断提高和生活习惯的改变，2型糖尿病的发病率持续上升，且现在已经成为全球死亡的首要原因。2型糖尿病属于多因素疾病，其中风险因素作用较强的有性别、年龄、家族史、肥胖和缺乏运动。研究得知遗传因素是糖尿病的发病中的遗传学基础，在随后的进一步研究，遗传学学者们确定

10、了2型糖尿病的特异基因。这些遗传学研究发现提示我们遗传基因似乎可以用来推测2型糖尿病的遗传易感性，从而可以用于2型糖尿病的预测、预防和早期判断。下面介绍单基因和多基因2型糖尿病。（1）单基因2型糖尿病遗传学学者们在研究中运用经典的定位克隆和候选基因方法成功的确定了单基因糖尿病基因1。并且得出这样一个结论，即大多数单基因糖尿病病因是细胞基因，导致细胞功能异常，而非胰岛素抵抗。同时治病基因的确定也导致某些临床亚型的发现。研究者们认为青年发病成年型糖尿病是常非胰岛素依赖、染色体显性遗传的早发型糖尿病，并且目前发现至少有8个亚型。其中相关的基因包括CEL（1%）、NeuroD1（1%）、HNF1A(6

11、%)、未知基因（11%）和GCK（占22%）2-7。研究者还将新生儿糖尿病分为了三种亚型，包括胰腺发育不良和症状型（10%）、暂时型（45%）和永久型（45%）。对青年发病成年型糖尿病的不断研究的同时也对其他类型的单基因糖尿病的研究有了更一定的进展，其中CEL基因是家族性糖尿病的罕见原因8。(2)多基因2型糖尿病单基因糖尿病其实只占糖尿病的一小部分，而大多数糖尿病患者所患的都是2型糖尿病。在研究中发现大量证据，这些证据都提示2型糖尿病的个体易感性是由多个因素共同决定的，其中就有多位点遗传变异和一系列环境因素，因此寻找常见的典型的2型糖尿病的特异基因变异的难度就比寻找单基因糖尿病的发病机制要大得

12、多。近几年，随着科学的不断进步和研究人员的不懈努力，在寻找多基因2型糖尿病的特异基因变异的研究也取得了非常显著的进展。在大规模的相关研究和应用全基因组相关研究中，研究人员确定了17个2型糖尿病易感性变异9,10。其中大多数易感性变异影响了细胞的功能或功能团，而有中度影响的多基因决定了个体遗传易感性，但由于条件限制对个体的预测作用却有限。由于研究的人群来自不同的地域，年龄，种族且生活习惯也不同，所以不同的患者具有基因型测定误差、种族背景复杂等问题，这就有可能得出相关的令人惊喜的结果，因此如果要得出确定的结论就必须进行重复基因型测定并且要在不同人群中证实，才可以认为是成因变异。在过去几年里，研究者

13、们在糖尿病的遗传学研究中取得了长足进展，所采取的基因组筛查方法也将有助于进一步探索2型糖尿病的发病机制。1.2.2 2型糖尿病的治疗研究新进展2型糖尿病是一种长期的隐形疾病，常常是直到出现并发症才得以确诊，大约三分之一的患者可能知道发病晚期才被发现。虽然目前还没有决定性证据表明，针对无症状人群进行大规模的筛查仪早期发现糖尿病前期和糖尿病的效果如何，然而，早期筛查对于2型糖尿病的研究还是非常有必要的。2型糖尿病前期和糖尿病都是一种非常常见的疾病并且发病率在逐年上升。这都给公共卫生系统带来了很大负担和挑战。一般来说，2型糖尿病在确诊之前都要经历一个漫长的无症状阶段。另外，高血糖持续时间长短是相关不

14、良预后的强预测因子，目前已经有一些有效的干预措施用来预防2型糖尿病前期进展为2型糖尿病，从而降低2型糖尿病并发症风险11。到目前为止许多降糖药物大多都只是初始降糖作用不错而后期基本失效。这是因为细胞功能障碍很难维持。所以2型糖尿病患者通常伴随常见的副作用低血糖、潜在的心血管风险、消化道不适、体重增加和周围水肿。因此，新的治疗方法只能平稳控制血糖，逆转或阻止细胞功能衰竭，帮助减轻体重，促进胰岛素作用，有益于心血管系统，同时避免低血糖而不能够在根本上治愈。目前，对于2型糖尿病的治疗药物研究已经有了新的进展。其中胰岛细胞功能衰竭成为了2型糖尿病治病机制的核心。在治疗药物的开发上，重点放在了胰岛细胞功

15、能改善及再生的药物开辟上，这将给2型糖尿病治疗开辟新的篇章。在2011年6月刚刚结束的第68届美国糖尿病学会年会期间，出现了二肽基肽酶4抑制剂，这是治疗2型糖尿病的新一类口服药物，因此二肽基肽酶4抑制剂的研究再次成为被关注的焦点，并且与其相关的医学继续教育会议也备受关注。二肽基肽酶4抑制剂反映了当前2型糖尿病治疗的新方向，即从单纯控制HbAIC向避免低血糖、改善细胞功能和稳定控制血糖的目标前进。(1)肠促胰岛素与2型糖尿病胰高血糖素样肽主要有远端肠道的L细胞分泌。葡萄糖依赖性促胰岛素多肽主要有存在于近端肠道的K细胞分泌。胰高血糖素样肽和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽分泌后由二肽基肽酶4快速裂解从而失

16、去生物学效应。胰高血糖素样肽不仅可以促进细胞葡萄糖依赖性地释放胰岛素，还可以通过葡萄糖依赖模式抑制细胞分泌胰高血糖素，从而抑制肝脏葡萄糖产生。葡萄糖依赖性促胰岛素多肽可促进细胞葡萄糖依赖性地释放胰岛素，即这种促进胰岛素释放的作用在血糖水平升高时非常明显，而血糖水平恢复正常时则消失。(2) 胰高血糖素样肽和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽与2型糖尿病在健康个体中，大约60%70%餐后胰岛素分泌反应（肠促胰岛效应）与胰高血糖素样肽和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽相关。2型糖尿病患者肠促胰岛效应仍然存在，但与健康个体相比有明显的降低，尤其是胰高血糖素样肽的分泌水平显著下降。(3)胰岛素及其类似物在2型糖尿病治疗中

17、的应用胰岛素临床上按其作用时间长短可以分为三类：长效胰岛素；中效胰岛素；短效胰岛素。由于有些患者使用胰岛素后会出现胰岛素过敏、体质增加和血糖波动大等不良反应，并且不能真正模拟人体生理性胰岛素的分泌模式，所以科学家研发出胰岛素类似物，这又为糖尿病的治疗提供了新的选择12。胰岛素类似物是通过修饰肽链，改变其细化结构和生物学特征，这样就可以模拟正常胰岛素的分泌模式，且结构相似，更适合人体生理需要。现在，用于临床的有：预混门冬30胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素和地特胰岛素等。预混门冬30胰岛素。预混门冬30胰岛素的分泌模式非常接近人体的生理状态，因此可以在早晚餐前皮下注射预混门冬30胰岛素

18、。如果午餐后血糖控制效果不理想，可用于午餐前加服双胍类或葡萄糖苷酶抑制剂。现在已经有研究证实，预混门冬30每天三次餐前即刻皮下注射有降低餐前喝餐后血糖的作用。赖脯胰岛素和门冬胰岛素。赖脯胰岛素和门冬胰岛素具有与胰岛素类似的生物效应，不易于胰岛素抗体结合的特性，这就避免了抗体引起胰岛素耐药。因此赖脯胰岛素和门冬胰岛素适用于各型糖尿病患者。这两种速效胰岛素类似物注射后由于能够很快发生解聚所以发生作用有持续时间短、效较快、达峰早的特点，并且能在餐前即刻注射，这个特性就能很好地模拟餐后胰岛素的分泌模式比餐前30分钟注射的常桂荣胰岛素控制餐后血糖效果更好；而且由于其作用持续时间的缩短，这就显著减少了低血

19、糖的发生率。同时，注射时间的灵活性也明显改善了2型糖尿病患者的依从性，能使患者获得接近正常的血糖控制，延迟并发症的发生和进展13。地特胰岛素和甘精胰岛素。地特胰岛素和甘精胰岛素进行皮下注射后作用可持续24h，且具有没有谷峰浓度变化，使用方便安全的特点。因此可作为基础胰岛素使用，同时也可与其他降糖药联合使用。但是于学静等14应用甘精胰岛素联合口服药物治疗2型糖尿病肥胖患者20例，对照组20例采取诺和灵30R治疗方案。观察12周后，有研究认为该类药不适用于儿童及孕妇。(4)磺酰脲类药物与2型糖尿病磺酰脲类药物。磺酰脲类药物具有作用强，起效快，作用维持时间短的特性。这就使得导致低血糖的可能性减少。通

20、过刺激胰岛细胞，使胰岛素分泌增加，适用于胰岛细胞功能尚未完全丧失的患者。1.3 2型糖尿病的其他治疗方法2型糖尿病发病早期，胰岛细胞功能损害是可逆的，因此改善早期胰岛素分泌缺陷，保护胰岛功能就是延缓糖尿病研究的研究重点15,16。糖尿病并发症及控制实验和英国糖尿病前瞻性研究研究均表明减少和预防糖尿病的各种并发症的重要措施是控制血糖使之达到理想水平，而胰岛素是糖尿病治疗中的重要手段，因此对于2型糖尿病患者强化治疗使血糖控制达标具有重要意义。有研究表明，多次胰岛素皮下注射者与胰岛素泵两种治疗方法均能有效控制上围胰岛素治疗的2型糖尿病患者的血糖，促进短期血糖达标。但胰岛素泵治疗在缩小血糖波动和整体血

21、糖控制方面比多次胰岛素皮下注射治疗更为显著。并能够缩短血糖达标时间，减少胰岛素用量和降低低血糖的发生率。1.4 胰岛细胞的研究1.4.1 胰岛细胞功能评价的方法胰岛细胞功能是指胰岛素脉冲样分泌以及对各种刺激物引起的胰岛素释放或分泌反应以及分泌其他多肽的能力。检测胰岛细胞功能的方法有两个：胰岛细胞分泌刺激试验和胰岛素脉冲样分泌模式的检测。人体中的胰岛素分泌呈脉冲式分泌模式,胰岛素的脉冲分泌包含两个组分: (1) 快速脉冲模式。快速脉冲模式的特点是振幅小,周期短,为510 min,在慢速脉冲基础上出现,主要抑制肝糖输出；(2) 慢速脉冲模式。慢速脉冲模式的特点是振幅大,周期长,为50120 min

22、,主要介导外周组织对葡萄糖的利用 17。脉冲式的分泌模式对胰岛素发挥正常的降糖作用意义重大，总量相等的胰岛素,当以脉冲式分泌时,其降糖效率与持续恒速分泌相比提高了30 %。2型糖尿病患者的脉冲式胰岛素分泌,其频率未变,但振幅降低18，动物实验也证明细胞数量减少能引起脉冲振幅降低,但其周期和规律仍正常19。2型糖尿病患者的胰岛素脉冲规律性与正常人相比有明显下降,胰岛素敏感性下降与胰岛素分泌规律减弱呈正相关。由此可见,胰岛素快速脉冲分泌的检测有助于细胞损伤及其相关疾病的早期发现和诊断,胰岛素脉冲周期改变可能是2型糖尿病的预测因子。细胞功能检测方法各有特点,选择合适的方法是正确评估细胞功能的前提。目

23、前国内外的研究显示,胰岛素脉冲样分泌的测定、高葡萄糖钳夹技术是评估细胞功能敏感性最高的试验,其他试验的敏感性由低到高依次为胰高血糖素试验、精氨酸试验。由于各种细胞功能试验方法在检测细胞功能损伤的敏感性方面存在差异,所以在糖代谢异常的不同临床阶段,并不是所有的试验方法都会得到与病程一致的结果。当方法选用不适时,常会造成低估或高估。大量研究提示（1）正常糖调节阶段：高糖钳夹实验可发现潜在的细胞功能减退，了解高危人群细胞可能存在的潜在缺陷。（2）细胞逐渐减退阶段：此阶段可出现胰岛素脉冲式分泌异常,可选用OGTT早期评价胰岛素分泌的指标。（3）糖尿病阶段：可将精氨酸试验及OGTT的两个时相胰岛素分泌反

24、应的变化作为判断细胞损伤程度或病情轻重的指标。细胞衰竭阶段：多选择胰升糖素试验来判断其衰竭程度。1.4.2 胰岛细胞功能评价的相关指数近几年运用OGTT 5个时间点的C肽值、血糖及胰岛素，借助数学模型和数学软件，建立评估胰岛素敏感性和胰岛细胞功能的指数成为研究者们正在努力研究的方向20,21。(1)稳态模型胰岛素分泌指数(HOMA-B)计算公式:HOMA-B=20FINS/(FPG-3.5)，其中FINS 为空腹胰岛素, FPG为空腹血糖,在胰岛细胞功能评估中可以同时调整胰岛素敏感性影响而使结果更接近于真实情况。因为胰岛细胞衰竭只有在葡萄糖负荷下才能充分暴露,而空腹状态只能部分地反映胰岛细胞功

25、能,因此该公式的缺点是容易高估胰岛细胞功能,因此在使用中需予以注意22。(2)早期相胰岛素分泌指数(Ins30/G30)早期分泌相对于调节正常人葡萄糖代谢有重要作用，是细胞功能受损的敏感指标。Ins30/G30= ( Ins30- Ins0) / (G30- G0 )，这个时间点所反映的早期相胰岛素分泌以第一相胰岛素分泌为主，但第二相胰岛素分泌也有部分贡献。这个指标在糖耐量减退阶段就发生改变，到糖尿病阶段则更加显著23。该指数可较好地反映早期胰岛素分泌功能24 。其存在的主要问题是评估时受胰岛素抵抗的干扰。(3)李-Bennett胰岛细胞功能指数(MBCI) MBCI=(FPGFINS)/(

26、PG2h+ PG1h-2FPG),其中FPG可用3.5 mmol/L，即MBCI=(FPGFINS)/(PG2h+PG1h-7.0)，胰岛素分泌指数MBCI对血糖水平的贡献与I30/G30、AIR、HOMA-B等诸多胰岛素分泌指数对血糖变化贡献的总和相当。前瞻性研究资料显示在皮马印第安IGT 人群中, MBCI和AIR能预测糖尿病的发生,但HOMA-B不能有效地预测糖尿病的发生 25。1.4.3 用于评估胰岛素敏感性的相关指数(1)稳态模型评估胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）HOMA-IR=FInsFPG/22.5，其中FIns单位为mU/L,FPG单位为mmol/ L，HOMA-IR作为一种

27、非侵入性评估胰岛素抵抗、简单可靠的方法被广泛应用于流行病学研究。而且在有大量样本存在的情况下,它与正糖钳夹结果密切相关，在糖尿病人群中其相关性亦存在26,适用于大样本的流行病学调查。（2）线性最小模型(LMM)在Bergman最小模型的基础上建立的线性最小模型(linear minimal model,LMM),LMM 将糖尿病诊断与数学模型有机结合，测定OGTT 5个时间点的血糖和胰岛素,借助计算机评估胰岛素敏感性及分泌功能(LMM-ISI和LMM-BCI)。LMM 与I0/G0、Defronzo-ISI和HOMA等相关性均较好。（3）OGTT中血糖曲线下面积AUCG/AUCI是基于葡萄糖-

28、胰岛素反馈环所建立的。在国内外临床特别是流行病学评估胰岛素抵抗的研究时常用的方法，由Himsworth等提出。但由于葡萄糖-胰岛素反馈的量效关系是呈函数关系，因此依据葡萄糖-胰岛素反馈关系建立AUCG/AUCI仍然不够准确。以上是一些胰岛素敏感性指数，胰岛素敏感性的临床评估是非常复杂但却是非常重要的问题,目前仍没有一致的意见，人们也只是根据自己的认知去选择。整体而言目前HOMA的应用最为广泛, 胰岛素抵抗和胰岛素敏感性是两个概念，胰岛素抵抗则更偏向于描述胰岛素作用的发挥受到的阻碍，胰岛素敏感性偏向描述胰岛素的作用。1.5 本课题研究的主要内容随着2型糖尿病的发病率的急剧升高，不论其临床治疗还是

29、相关的科学研究，胰岛细胞功能评价都显得非常具有必要性，但由于胰岛细胞有2个胰岛素分泌时相，存在时限和分泌量的变化，并且受胰岛素抵抗和糖负荷刺激的双重调节，以及对不同的刺激物反应不同，这些都决定了胰岛素分泌方式的复杂性。因此测定胰岛细胞对于治疗2型糖尿病具有十分重要的意义。本研究初步探讨通过免疫组织化学方法测定胰腺中胰岛细胞。从而为2型糖尿病的进一步研究奠定基础。而胰岛细胞功能评价的方法及相关指数合理的应用，取长补短，才能给我们的2型糖尿病的临床科研工作带来更大的贡献。2实验部分2.1 主要材料2.1.1 实验动物取小鼠若干只（重庆医科大学实验动物中心提供）体重80120 g,。动物单独饲养，室

30、温202，12:12h昼夜循环光照，自由进食、饮水。动物于实验前适应实验室环境1周。2.1.2 实验药品及试剂名 称生 产 商多聚甲醛(4%,PFA)天津大茂化学试剂厂无水乙醇重庆川东化工（集团）有限公司 化学试剂厂15%蔗糖溶液成都科龙化工试剂厂30%蔗糖溶液成都科龙化工试剂厂OCT包埋剂Jung Tissue Freezing MediumTris生工生物工程（上海）有限公司Tris-HCl生工生物工程（上海）有限公司氯化钠重庆川东化工集团有限公司10%驴血清成都市科龙化工试剂厂Anti-insulinSC-9168 Santa Cruz BlotechnolgyAlexa Fluro55

31、5 donkey anti-rabbit IgG(H+L)Eugene.OR.USADAPISigma,D-9452Fluromount封片剂Sigma,F4680-25ML2.1.3实验仪器和设备名 称型 号生 产 商电子天平FA1604s上海天平仪器厂纯水机美国Millipore公司酸度计（pH计）DELTA320梅特勒-托利多仪器有限公司恒温干燥箱CS101-1AB重庆银河试剂有限公司冰箱BCD-208A青岛海尔股份有限公司通风柜DFT长海实验设备有限公司平板加热磁力搅拌器CL4A型郑州长城科工贸有限公司调速多用振荡器HY-2金坛市晶波实验仪器厂Leica1850切片机CM-1850徕卡仪器有限公司防脱载玻片（Poly-L-lysine）CAT.NO7150北京金麦克生物技术有限公司2.2 实验原理2.2.1 免疫组化概念免疫组化是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)