急性淋巴细胞白血病患儿红血球中6巯基嘌呤及其代谢产物的精.docx

1、急性淋巴细胞白血病患儿红血球中6巯基嘌呤及其代谢产物的精急性淋巴细胞白血病患儿红血球中6巯基嘌呤及其代谢产物的HPLC分析项目完成人：牟德海 郑家概 闫世平 辜英杰 喻凌寒项目完成单位：中国广州分析测试中心 广东省化学危害应急检测技术重点实验室6巯基嘌呤（6-mercaptopuring, 6MP）和硝基咪唑硫嘌呤（azathiopurine, Aza）主要作为抗肿瘤药用于治疗急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL），或者作为免疫抑制剂用于治疗炎性肠病、风湿关节炎、系统性红斑狼疮和抑制器官移植病人的急性排斥。Aza是6MP的1甲基4硝基5咪唑硫衍

2、生物，在体内降解生产6MP，Aza抗肿瘤和免疫抑制的药物活性主要是来自其降解产物6MP的代谢产物。图1. 6巯基嘌呤的代谢16MP在体内的代谢主要有三条途径：（1）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的作用下转化为6硫次黄嘌呤核苷一磷酸（6-thioinosine monophosphate，TIMP），TIMP随后在一系列酶促反应中转化为活性代谢物6硫鸟嘌呤核苷（6thioguanine nucleotides, 6TGNs）发挥细胞毒作用；（2）在硫嘌呤甲基转移酶（thiopurine

3、methyltransferase，TPMT）作用下转化为无药物活性的甲基硫嘌呤（6methylmercaptopurine, 6MMP）;（3）在黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）作用下转化为6硫尿酸（6thiouric acid, 6TUA）1，见图1。与6MP转化为活性代谢产物性6TGNs相竞争的有两条途径：在TPMT作用下转化为6MMP和在XO作用下转化为6TUA。XO活性在个体之间的差异不大，而TPMP活性在不同个体之间有很大的差异。因而病人对6MP反应（即药物的疗效和毒性）的差异主要决定于其体内TPMT的活性。已经发现红细胞中6TGNs的含量与TPMT的活性呈负

4、相关关系。在标准用药剂量下，TPMT活性低的个体能积累高浓度的6TGNs导致致死性的骨髓细胞毒性。相反TPMT活性高的个体对硫嘌呤类药物可能没有反应，因为它们很快就被转化为无活性的6MMP。因而通过监测接受硫嘌呤类药物治疗的病人血红细胞内6MMP和6TGNs的水平，据此确定准确的用药剂量，对提高治疗效果、减小药物毒副作用是非常关键的。在本项目的资助下，我们与广州医学院第一附属医院合作，研究建立了急性淋巴细胞白血病患者红血球中6MP及其代谢产物的高效液相色谱分析方法，为6MP个性化治疗提供基础。1 实验1.1 仪器与试剂6巯基嘌呤（6mercaptopurine, 6MP）、6硫鸟嘌呤（6thi

5、oguanine, 6TG）、6硫黄嘌呤（6thioxanthine, 6TX）、6甲基硫嘌呤（6methyl mercaptopurine, 6MMP）、戊醇、乙酸苯汞（phenyl mercury acetate, PMA）和二硫苏糖醇（DLdithiothreitol, DTT）为Sigma公司产品；甲醇、甲苯为色谱纯，其他试剂均为分析纯。高效液相色谱仪：岛津LC6A，配LC6A高压输液泵、柱温箱、SPD-6AV可变波长紫外可见分光检测器、系统控制器、CR3A积分仪和色谱工作站。1.2 试剂配制（1）PMA戊醇甲苯溶液的配制：取1.85 mL戊醇，加入1000 mL甲苯中，摇匀，再加入0

6、.5 g PMA，轻轻搅动1 h使PMA溶解，置于暗处保存。此溶液含PMA 1.3 mmol/L，含戊醇170 mmol/L。（2）3.75 mmol/L DTT水溶液配制：取289.2 mg DTT溶于500 mL水中。（3）0.5 mol/L H2SO4。（4）3.4 mol/L NaOH。（5）0.1 mol/L HCl。1.3 标准溶液配制分别取16.8 mg 6TG、16.6 mg 6MMP、17.0 mg 6TX和17.1 mg 6MP溶于水中并定容于100 mL，此溶液为贮备液I，含每种硫嘌呤1.00 mol/mL。取10 mL贮备液I，稀释至100 mL，为贮备液II，含每种硫

7、嘌呤100 nmol/mL；用贮备液II稀释成1 nmol/mL、2 nmol/mL、5 nmol/mL、10 nmol/mL、15 nmol/mL和20 nmol/mL的系列标准溶液备用。1.4 样品处理（1）血红细胞制备：采集正在接受硫嘌呤治疗的病人全血样本，肝素锂抗凝，室温下1000g离心10 min，弃去血浆和白血胞，红细胞以2倍体积的生理盐水洗涤两次，最后红细胞重新悬浮于生理盐水中，使红细胞的浓度约为8108细胞/200L。取少量作红细胞的准确计数，其余在20下保存至分析。（2）样品提取：200 L血红细胞（约含8108红细胞）加入有800 L 3.75 mmol/L DTT的10

8、mL螺旋口试管中，再加入500 L 0.5 mol/L的H2SO4，盖紧，置于100烘箱中水解1 h。在这一步中，硫嘌呤核苷水解转化为相应母体硫嘌呤和甲基硫嘌呤，如6TGNs水解生成6TG、6TIMP水解生成6MP、6甲基巯基嘌呤核苷转化为6MMP，硫嘌呤和甲基硫嘌呤可以和乙酸苯汞形成复合物而被有机溶剂萃取出来。水解物冷却后，向水解管中加入500 L 3.4 mol/L的NaOH后立即加入6 mL PMA戊醇甲苯溶液，振荡10 min，离心。吸取5 mL甲苯相于具塞离心试管中，加入200 L 0.1 mol/L HCl，在旋转混合器上混合320 s，离心，弃去上层甲苯相，取水相50 L注入色谱

9、仪进行于HPLC分析。1.5 色谱条件色谱柱：C18反相柱。流动相A：0.2%的乙酸水溶液；流动相B：甲醇。梯度洗脱程序：其中016 min为分析梯度，四种物质在16min内全部出峰，1615 min为洗色谱柱的时间。时间（min）A浓度（）B浓度（）01000162080160100250100251000检测波长：012.5 min波长为340 nm，检测6TG、6MP和6TX；12.5 min后切换到290 nm，检测6MMP。柱温：40。流速：1.0 mL/min。进样体积：10 L。2 结果2.1 色谱图在上述色谱条件下， 6TG、6MP、 6TX和6MMP混合标准溶液的色谱图见图2

10、，四种物质出峰的时间依次为9.26、9.96、10.84和15.57 min。从图2可以看出，色谱分离状况良好，峰形对称，四种物质均达到基线分离，分离度1.5。图2. 梯度洗脱分析6MP及其代谢产物的高效液相色谱图色谱柱：C18；流动相流A：0.2%的醋酸，流动相B：甲醇；梯度：0 min时，100%A， 16 min时， 20%A80%B，检测器：012.5 min为340 nm， 检测6TG、6MP、 6TX，12.5 min以后切换为290 nm，检测6MMP；柱温：40；流速：1.0 mL/min。进样量：每种物质100 pmol/10 L。保留时间：6TG，9.26 min；6MP

11、9.96 min，6TX 10.85 min；6MMP，15.57 min。2.2 标准曲线将1 nmol/mL、2 nmol/mL、5 nmol/mL、10 nmol/mL、15 nmol/mL和20 nmol/mL的系列混合标准溶液进样10 L，得到每种物质的峰面积，峰面积对进样量进行线性拟合，拟合结果见表1和图3。本方法对红血球中10 pmol/8108 RBC 含量水平的6TG、6MP、 6TX和6MMP可进行准确地检出和定量分析，满足临床应用的要求。表1. 6TG、6MP、6TX和6MMP的标准曲线及线性拟合参数进样量pmol峰面积6TG6MP6TX6MMP1010238802669

12、9612018251732583819865044234032110954639100905182562323294351501409212985337931362120018907166294301619012Y=aX+by=94.5x-130.2y=84.1x-9.4y=213.5x+1077.7y=93.6x+9.3R20.99930.99890.99800.9989图3. 6TG、6MP、6TX和6MMP的标准曲线2.3 精密度和准确度向未接受硫嘌呤治疗的健康人红血球中加入低、中和高三个浓度的混合标准溶液，然后按照1.4的方法进行处理，按1.5的方法进行色谱分析，平行5份样品，计算每个

13、标准加入水平下的回收率及其变异系数，结果见表2。表2. 6TG、6MP、6TX和6MMP分析的精密度和准确度加入量批内（n=5)批间（n=5)(pmol)测得量回收率RSD测得量回收率RSD(pmol)(%)(%)(pmol)(%)(%)平均值SD平均值SD6-TG2019.2 0.9 96.0 4.7 19.1 1.5 95.5 7.9 5048.1 2.1 96.2 4.4 47.3 4.7 94.6 9.9 200188.1 4.6 94.1 2.4 194.4 11.3 97.2 5.8 6-MP2019.7 0.9 98.5 4.6 19.2 1.4 96.0 7.3 5049.3

14、2.2 98.6 4.5 47.9 4.1 95.8 8.6 200194.5 5.6 97.3 2.9 194.4 12.3 97.2 6.3 6-TX2019.4 0.7 97.0 3.6 19.0 1.4 95.0 7.4 5048.9 2.3 97.8 4.7 48.5 4.5 97.0 9.3 200195.3 7.3 97.7 3.7 190.4 12.3 95.2 6.5 6-MMP2019.2 0.8 96.0 4.2 19.1 1.5 95.5 7.9 5049.4 2.0 98.8 4.0 47.3 4.7 94.6 9.9 200196.3 7.6 98.2 3.9 19

15、4.4 10.4 97.2 5.3 2.4 样品分析结果在建立上述能同时分析6TG、6MP、6TX和6MMP等4种物质的HPLC方法之前，我们首先建立了前3种物质6TG、6MP和6TX的HPLC方法。本方法采用等度洗脱，具体如下：色谱柱：C18；流动相为10：90的甲醇水，含100mmol/L三乙胺并用磷酸调pH值为3.2，脱气前加入0.5 mmol/L的DTT；流速：1.0 ml/min；检测波长：335 nm。色谱图见图4。从图4可以看出，6TG、6MP和6TX在等度洗脱的条件下，在8 min内得到了很好的分离。方法的线性、精密度和准确度均满足要求。但用这个方法，在我们的实验条件下，6MM

16、P不易出峰。我们用等度洗脱方法，分析了正在接受硫嘌呤药物治疗的ALL患者的49份血样，典型的色谱图见图4B。以正常健康人的血样为空白对照，其色谱图见图4C，分析结果见表3。ABC图4. 等度洗脱分析6TG、6MP和6TX的高效液相色谱图A混合标准，B正在接受硫嘌呤药物治疗的ALL患者血样，C正常健康人的血样。色谱柱：C18；流动相为10：90的甲醇水，含100mmol/L三乙胺并用磷酸调pH值为3.2，脱气前加入0.5 mmol/L的DTT；流速：1.0 ml/min；检测波长：335 nm。保留时间：6-TG，4.72 min；6-MP，5.46 min；6-TX，7.17 min。表3.

17、接受硫嘌呤药物治疗的ALL患者红血球中6TG、6MP和6TX的等度洗脱高效液相色谱分析结果（单位：pmol/8108 RBC）No6-TG6-MP6-TXNo6-TG6-MP6-TX10101027101010201010289101030101029193101042110103011010105271010311036106010103210101073512103310101080101034510109231010351010101015101036101010115015103710101012017103813813103910101014010104010101015814104

18、11010101601010421010101718810431410101854351044101010194510101020461010102114101047101010221310104816101023211010491410102401010501010102554105110101026651010在本项目的研究中，我们先建立了等度洗脱高效液相色谱法，并用此方法分析了一批临床样品。由于等度洗脱法6MMP不能很好出峰，我们继续对方法进行改进，采用梯度洗脱程序，在优化的实验条件下，在16 min内6TG、6MP、6TX和6MMP得到良好的分离，并用向正常健康人血样中加标的方法进行了

19、精密度和准确度实验，结果良好。由于ALL患者血样不易得到，所以还没有用梯度洗脱HPLC法分析ALL患者红血球中6MP及其代谢物的结果。3 讨论由于硫嘌呤类药物治疗ALL等疾病的效果和毒副作用在患者个体之间的差异很大，所以，在治疗的过程中监测病人体内硫嘌呤类药物的活性代谢学产物（如6TGNs）和非活性代谢产物（如6MMP），并以次为依据调整治疗和用药方案，进行个体化治疗，对提高药物疗效、减小毒副作用具有非常主要的意义。Lennard和Singleton2, 3建立了同时测定红细胞中6TGNs和6MMPNs的HPLC方法，其样品处理方法是将红细胞样品在1.0 mol/L的H2SO4介质中于100

20、下水解1 h，使6TGNs和6MMPNs水解为相应的母体硫嘌呤6TG和6MMP，然后在碱性介质中用含乙酸苯汞的甲苯溶液将6TG和6MMP萃取到有机相甲苯中，再用0.1 mol/L的HCl将6TG和6MMP反萃到水相中，用于高效液相色谱分析。在样品水解的过程中加入DTT以防止含硫基团被氧化。PMA萃取的效率与萃取时的pH值密切相关，碱性越强，萃取效率越高10。Dervieux和Boulieu4, 5的样品处理方法是在红血球中加入固体DTT，然后用HClO4沉淀蛋白，离心，提取液于100 下水解45 min，将硫嘌呤核苷水解转化为相应的硫嘌呤，水解液直接用于HPLC分析。Dervieux和Boul

21、ieu的研究结果表明，6MMPNs在酸水解的过程中会转化为4氨基5（甲硫基）羰基咪唑衍生物，转化效率与水解时的pH密切相关，在硫嘌呤核苷水解转化为硫嘌呤的条件下，6MMPNs的转化率为100。因而在色谱分析时色谱图上没有6MMP的色谱峰，而有6MMP衍生物的色谱峰。他们认为本方法不能直接测定6MMP，但可以通过其衍生物间接测定。但Hawatari等6, 7稍作修饰的Dervieux和Boulieu方法却在色谱图中得到了6MMP的色谱峰，他们认为水解时6MMP并不能完全转化，因而可以直接测定红细胞中6MMP的含量。Su等11用100 L血浆，相向中加入25 L 1 mol/L的HCl，旋转混合，

22、置上冷却，在加入25 L TE缓冲液，旋转混合，置冰上冷却后离心超滤除去蛋白质，取50 L注入液相色谱仪分析。分析时用C18反相柱，梯度洗脱，在40分钟内6MP及其7种代谢产物得到良好分离。这7种代谢物是6TG、6TX、6巯基嘌呤核苷（6mercaptopurine riboside, rMP）、6硫鸟嘌呤核苷（6thioguanosine, rTG）、6硫黄嘌呤核苷（6thioxanthine riboside, rTX）、6MMP和6甲基巯基嘌呤核苷（6methylmercaptopurine riboside, rMMP）。这种处理方法由于不用水解，可以同时测定硫嘌呤和硫嘌呤核苷。Shi

23、pkova等8, 9对比研究了Lennard和Singleton方法与Dervieux和Boulieu方法。结果表明，用Dervieux和Boulieu的方法测得的TGNs的含量是用Lennard和Singleton的方法测得的含量的2.6倍，虽然两种方法所得到的结果是显著相关的。如果将Lennard和Singleton方法中水解介质有H2SO4改为HClO4，则两种方法的差异减小到1.4倍。Stefan等也报道了近似的结果9。文献报道的6MP及其代谢产物的分析结果相差很大，各实验室之间的结果可比性很差，数据也无法交流和共享，这主要与样品处理和提取方法有关。因此，分析方法的标准化是今后研究工作

24、的重点10。参考文献1 Cuffari C, Seidman EG, Latour S and Thort Y. Quantitation of 6-thioguanine in peripheral blood leukocyte DNA in Crohns disease patients on maintenance 6-mercaptopurine therapy. Can. J Physiol Pharmacol. 1996, 74: 580-585.2 Lennard L. Assay of 6-thioinosinic acid and 6-thioguanine nucleot

25、ides, active metabolites of 6-mercaptopurine, in human red blood cells. J Chromatogr 1987; 423: 169 78.3 Lennard L, Singleton HJ. High-performance liquid chromatographic assay of the methyl and nucleotide metabolites of 6-mercaptopurine: quantitation of red blood cell 6-thioguanine nucleotide, 6-thi

26、oinosinic acid and 6-methylmercaptopurine metabolites in a single sample. J Chromatogr 1992; 583: 8390.4 Boulieu R, Dervieux T. High-performance liquid chromatographic determination of methyl 6-mercaptopurine nucleotides (Me6-MPN) in red blood cells: analysis of Me6-MPN per se or Me6-MPN derivative?

27、 J Chromatogr, B. 1999, 730: 2734.5 Dervieux T, Boulieu R. Simultaneous determination of 6-thioguanine and methyl 6-mercaptopurine nucleotides of azathioprine in red blood cells by HPLC. Clin Chem. 1998; 44: 551 5.6 Mawatari H, Kato Y, Nishimura S-I, Sakura N, Ueda K. Reversed phase high-performance

28、 liquid chromatographic assay method for quantitating 6-mercaptopurine and its methylated and non-methylated metabolites in a single sample. J Chromatogr, B. 1998, 716: 392 396.7 Mawatari H, Kato Y, Nishimura S-I, Sakura N, Ueda K. Comments on High-performance liquid chromatographic determination of