食源性致病菌检验实用标准操作程序.docx

1、食源性致病菌检验实用标准操作程序食源性致病菌检验标准操作程序福建省疾病预防控制中心二一二年十一月 一、 生物样本检验标准操作程序（一） 粪便样本的保存、运送和检测表1 粪便样本的保存、运送和检测培养条件培养基目标病原体温度细菌标本保存和运送1.CaryBlair所有食源性致病菌室温增菌液1.改良磷酸盐缓冲液小肠结肠炎耶尔森氏菌4 2.mEC增菌肉汤EHEC O157:H7/STEC37 3.Preston肉汤弯曲菌微需氧42 4.SBG增菌液沙门氏菌37 5.3%氯化钠碱性蛋白胨水弧菌37 选择性分离平板1.Mac平板EPEC、STEC、ETEC、EIEC、EAEC、志贺氏菌37 2.XLD平

2、板志贺氏菌37 3.mCCD平板弯曲菌微需氧42 4.耶尔森氏菌选择性平板小肠结肠炎耶尔森氏菌25 5.科玛嘉O157:H7显色平板EHEC O157:H737 6.科玛嘉沙门氏菌显色平板沙门氏菌37 7.科玛嘉弧菌显色平板TCBS平板弧菌37 病毒标本1.采便盒轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒-20 以下（二） 检验方法与流程（三） 沙门氏菌和志贺氏菌检测操作程序11范围本程序规定了粪便标本中沙门氏菌（Salmonella）和志贺氏菌（Shigella）的检验方法。12检验程序沙门氏菌和志贺氏菌检验程序见图1。图1沙门氏菌和志贺氏菌检验程序13操作步骤13.1标本收集标本包括新

3、鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h内送检。13.2分离培养直接分离培养新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在XLD和MAC一区划线；以1 L无菌接种环或接种针划线分离。在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入SBG增菌

4、液。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入SBG增菌液。肛拭子：操作程序同新鲜粪便。转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；拭子在XLD和MAC一区划线；以1 L无菌接种环或接种针划线分离；在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入SBG增菌液。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入SBG增菌液。平板36 1 培养18 h24 h。增菌培养增菌液于36 1 培养18 h24 h，采用上述方法于科玛嘉沙门氏菌显色平板上划线分离，36 1 培养18 h24 h。13.3菌落特征选择性平板上可疑菌落的特征见表1。表1 沙门氏菌属和志

5、贺氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌（大多数）伤寒沙门氏菌志贺氏菌属MAC琼脂菌落光滑、无色，直径2 mm3 mmXLD琼脂菌落呈红色，直径2 mm4 mm科玛嘉显色培养基紫色或酒红色紫色或酒红色13.4纯培养挑取3个或以上可疑菌落，划线接种5%羊血琼脂平板，36 1 培养18 h24 h。13.5初步鉴定可疑菌落接种TSI琼脂，赖氨酸脱羧酶培养基、动力-靛基质-鸟氨酸琼脂（MIO）、西蒙氏柠檬酸盐琼脂和尿素琼脂。沙门氏菌属和志贺氏菌属生化反应初步鉴别见表2。表2 沙门氏菌属和志贺氏菌属生化反应初步鉴别表项目沙门氏菌（大多数）伤寒沙门氏菌甲型副伤寒沙门氏菌志贺氏菌属T

6、SI（斜面）KKKKTSI（底层）AAAATSI（产气）TSI（硫化氢）少量赖氨酸MIO（动力）MIO（靛基质）可变MIO（鸟氨酸）痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌：宋内志贺氏菌：柠檬酸盐（西蒙氏）尿素13.6血清学鉴定挑取5%羊血琼脂平板上的菌落，进行沙门氏菌和志贺氏菌的血清学鉴定，设盐水对照。13.7确定鉴定刮取5%羊血琼脂平板上的单个菌落，进行系统生化鉴定。14结果与报告报告粪便标本中检出沙门氏菌或志贺氏菌。15菌株的保存和上送培养物穿刺接种半固体培养基，轻拧管盖，36 1 培养24 h，盖紧管盖。如果需要长期保存菌株，将0.7 mL 脑心浸液肉汤6 h12 h培养物和0.3 m

7、L 灭菌甘油加入灭菌菌种管，立即放置70 C保存。按照方案要求定期上送。（四） 致泻大肠埃希氏菌检测操作程序16范围本程序规定了粪便标本中致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli）的检验方法。17操作步骤17.1标本收集标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥

8、、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h内送检。17.2直接分离培养新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在MAC一区划线；以1 L无菌接种环或接种针划线分离。肛拭子：操作程序同新鲜粪便。转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；拭子在MAC一区划线；以1 L无菌接种环或接种针划线分离。平板36 1 培养18 h24 h。17.3菌落特征挑取5个可疑大肠埃希氏菌菌落（粉红色、突起、光滑、湿润）直接保存半固体菌种管；采用PCR检测特异毒力基因方法鉴别5种致泻大肠埃希氏菌。18多重PCR鉴定18.1标准菌株标准菌株一览表见表3。表3 标准菌

9、株一览表菌株名称标准号来源EPECCMCC 44155中国食品药品检定研究院STEC具有stx1、stx2毒力基因中国疾病预防控制中心传染病所ETECCMCC 44815中国食品药品检定研究院EIECCMCC 44825中国食品药品检定研究院EAEC042血清型中国疾病预防控制中心传染病所大肠埃希氏菌ATCC 25922WHO18.2引物合成多重PCR引物序列见表4。表4 五种致泻大肠埃希氏菌目的基因引物序列目标菌目标基因引物序列片段大小（bp）EPEC、STECescVF5-ATT CTG GCT CTC TTC TTC TTT ATG GCT G-3544escVR5-CGT CCC CT

10、T TTA CAA ACT TCA TCG C-3EPECbfpBF5-GAC ACC TCA TTG CTG AAG TCG-3910bfpBR5-CCA GAA CAC CTC CGT TAT GC-3STECstx1AF5-CGA TGT TAC GGT TTG TTA CTG TGA CAG C-3244stx1AR5-AAT GCC ACG CTT CCC AGA ATT G-3stx2AF5-GTT TTG ACC ATC TTC GTC TGA TTA TTG AG-3324stx2AR5-AGC GTA AGG CTT CTG CTG TGA C-3ETECEltF5-GAA

11、CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT G-3655EltR5-CTT TCA ATG GCT TTT TTT TGG GAG TC-3estIaF5-CCT CTT TTA GYC AGA CAR CTG AAT CAS TTG-3157estIaR5-CAG GCA GGA TTA CAA CAA AGT TCA CAG-3estIbF5-TGT CTT TTT CAC CTT TCG CTC-3171estIbR5-CGG TAC AAG CAG GAT TAC AAC AC-3EIECinvEF5-CGA TCA AGA ATC CCT AAC AGA AGA ATC

12、AC-3766invER5-CGA TAG ATG GCG AGA AAT TAT ATC CCG-3EAECastAF5-TGC CAT CAA CAC AGT ATA TCC G-3102astAR5-ACG GCT TTG TAG TCC TTC CAT-3aggRF5-ACG CAG AGT TGC CTG ATA AAG-3400aggRR5-AAT ACA GAA TCG TCA GCA TCA GC-3PicF5-AAA TGT CAG TGA ACC GAC GAT TGG-31111PicR5-AGC CGT TTC CGC AGA AGC C-3通用uidAF5-AAA G

13、TG TGG GTC AAT AAT CAG GAA GTG-31487uidAR5-ATG CCA GTC CAG CGT TTT TGC-318.3标本处理刮取营养平板上的过夜新鲜培养物1环2环，至装有1 mL0.85%灭菌生理盐水的Eppendorf管内，混匀。4 8 ，12 000 r/min离心15 min，弃去上清。沉淀加入100 L灭菌去离子水中，混匀。100 煮沸12 min，12 000 r/min离心5 min，上清即为PCR扩增模板，可直接用于PCR反应。18.4多重PCR五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重PCR扩增加样体系见表5。PCR反应条件：预变性94 5 min。变

14、性94 30 s，复性63 30 s，延伸72 1.5 min，30个循环。最后72 延伸5 min。表5 五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重PCR扩增加样体系试剂加样体积（L）dH2O8.310PCR Buffer2.525 mM MgCl22.52.5 mM dNTPs3.025 M escVF0.425 M escVR0.425 M bfpBF0.125 M bfpBR0.125 M stx1AF0.225 M stx1AR0.225 M stx2AF0.425 M stx2AR0.425 M eltF0.125 M eltR0.125 M estIaF0.425 M estIaR0.42

15、5 M estIbF0.225 M estIbR0.225 M invEF0.225 M invER0.225 M astAF0.425 M astAR0.425 M aggRF0.225 M aggRR0.225 M picF0.225 M picR0.225 M uidAF0.225 M uidAR0.23 U/L Taq酶0.7DNA模板2.018.5检测结果的判定取5 L PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。根据特异性核酸条带大小和数目判断致泻大肠埃希氏菌的种类。见图2。图2种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重PCR扩增片段注：图中标示EPEC、EHEC（STEC）、ETEC、EIEC、E

16、AEC的泳道为反应体系中仅存在相应的一种模板和12对引物同时扩增后出现的片段，而MIX泳道为将五种致泻大肠埃希氏菌混合后与12对引物同时扩增后出现的片段。19血清学鉴定19.1挑取PCR扩增阳性菌种，营养平板分离，36 1 培养过夜。19.2根据PCR鉴定结果，用相应致病大肠血清O多价、单价、K、H诊断血清进行血清玻片凝集试验进行诊断。见表6。表6 常见致泻大肠埃希氏菌的O血清群及血清型婴幼儿腹泻成人和儿童腹泻EPECETECEIECSTECEAECO20 O26 O44O6:K15:H16 O8:K40:H9O28acO157:H7O9:K99O55 O86 O111O8:K25:H9 O8

17、:H47:H-O112O26:K62:H11O101:K99O114 O119 O125O11:H27 O15:H11O124O111O126 O127 O128O20:H- O25:K7:H42O136O103O142 O158O25:K98:H- O27:H7O143O145O27:H20 O63:H12O144O104O73:H45 O78:H11O152O78:H12 O85:H7O164O114:H21 O115:H511）O127:H12 O128:H7O128:H21 O139:H28O148:H28 O149:H4O159:H4 O159:H20O159:H34 O166:H2

18、7O169:H-注：1：无动力的变异19.3报告血清学实验结果。110生化鉴定110.1对PCR阳性、血清学可分型及不可分型菌株进行系统生化鉴定。110.2报告最终鉴定结果。111菌株保存和上送4 或室温保存的半固体培养基保菌菌种至少2套（穿刺接种后36 培养过夜即可）或30%甘油肉汤冻存管-70 保存菌株至少2套。按照要求定期上送。（五） 大肠埃希氏菌O157:H7检测操作程序112范围本程序规定了粪便标本中大肠埃希氏菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）的检验方法。113检验程序大肠埃希氏菌O157:H7检验程序见图3。图3大肠埃希氏菌O157:H7检验程序1

19、14操作步骤114.1标本收集标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h内送检。114.2增菌培养增菌液采用添加20 mg/L新生霉素的改良EC肉汤（EC）。将采集的一支便拭子1:10接种于6 mL mEC肉汤，36 1 恒温摇床增菌培养6 h（如无摇床

20、，36 1 恒温增菌培养9 h12 h）。114.3大肠埃希氏菌O157:H7胶体金试纸快速筛查将胶体金试纸从袋中取出，平放于洁净、干燥的工作台上，编号；用加样器吸取样品增菌液150 L，加入检测卡一端的加样孔；2 min20 min内读取结果。阴性样品在视窗上部出现一条单一的红色对照线，这表明试剂已正确流动且检测过程已发生。阳性样品将显示两条红色带，这表明检出O157抗原。如果红色条带出现，实验失败，应考虑重做。114.4免疫磁珠集菌将O157胶体金试纸呈阳性的mEC增菌肉汤，进行免疫磁珠集菌。取下磁铁板，将编好号的1.5 mL的Eppendorf离心管，置入Dynal MPC-M架上。轻柔

21、混匀抗O157免疫磁珠（反复颠倒，直到管底沉淀完全消失），吸取抗O157免疫磁珠，置入每只编号的Eppendorf离心管中20 L。取胶体金试纸阳性增菌培养物1 mL，加入上述对应的Eppendorf离心管中。盖紧盖子。轻轻颠倒混匀。置于Dynal MX3旋转培养器上，室温下，旋转30 min（如果没有旋转器，可人工旋转）。将磁铁板插入Dynal MPC-M管架中，反复颠倒数次，将抗O157免疫磁珠吸附沉淀在Eppendorf离心管壁上。吸去上清（包括残留在管盖上的液体），并弃掉。将磁铁板从Dynal MPC-M架抽出。每只Eppendorf离心管中加入1 mL PBS-Tween20（PH7

22、.4），轻轻颠倒混匀，重新悬浮免疫磁珠。重复3.4.53.4.6步骤重复3.4.5步骤。用50 L PBS-Tween20 重新悬浮免疫磁珠细菌混合物。114.5接种选择性平板将50 L免疫磁珠细菌混合物用接种环划线或L棒涂布分别接种于O157:H7科玛嘉显色平板或山梨醇麦康凯平板（SMAC）各一块，36 1 培养18 h24 h；在SMAC平板上O157:H7菌落应为扁平、透明或半透明、表面光滑湿润、不发酵山梨醇乳白色菌落，极少部分迟缓发酵山梨醇，呈红色。边缘光滑，直径约2 mm。在O157：H7科玛嘉显色培养基上呈淡紫色或紫红色菌落。114.6初步鉴定对疑似菌落染色为革兰阴性杆菌者，在上述

23、平板挑取疑似菌落1020个，转种克氏双糖（KIA）培养基，36 1 培养16 h20 h。如其生长性状为葡萄糖（+）、乳糖（+）、产气（+）、硫化氢（-）者。114.7诊断血清凝集试验可疑菌株可用大肠埃希氏菌O157抗血清和O157单克隆抗体进行玻片凝集，凝集强度达（+），再用H7抗血清凝集鉴定。同时设盐水做对照。上述，冷冻，真空抽干，并于真空状态下封口保存。若患者不能自然排除O157:H7与肠杆菌科的某些菌种存在抗原交叉现象，例如：弗劳地柠檬酸杆菌、赫尔曼埃希氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等，一般可通过单克隆抗体解决，但弗劳地枸椽酸杆菌与O157:H7的O抗原交叉反应用单克隆抗体也无法

24、辨别，只可通过检测O抗原编码基因鉴别。114.8API 20E生化鉴定试剂盒采用API 20E生化鉴定试剂盒进行鉴定，生化反应编码:大多为 5144172，极少数为1144172或5144162。115菌株保存和定期上送4 或室温保存的半固体培养基保菌菌种至少2套（穿刺接种后36 培养过夜即可）或30%甘油肉汤冻存管-70 保存菌株至少2套。按照方案要求定期上送。116多重PCR毒力基因鉴定PCR扩增O157、H7编码基因，并且检测stx1、stx2、hly、eae毒力基因。典型的造成人类感染的大肠埃希氏菌O157:H7为O157+、H7+，并且携带志贺毒素、溶血素与粘附抹平因子：stx1+、

25、stx2+、hly+、eae+，我国大部分O157:H7菌株不携带stx1，为stx1-、stx2+、hly+、eae+。多重PCR各对引物序列见表7。表7 多重PCR毒力基因鉴定的引物目标基因引物序列片段大小（bp）stx1F 5-ATA AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC-3R 5-AGA ACG CCC ACT GAG ATC ATC-3180stx2F 5-GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC-3R 5-TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCT-3255eaeAF 5-GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC-3R 5-CC

26、A CCT GCA GCA ACA AGA GG-3384hlyAF 5-GCA TCA TCA AGC GTA CGT TCC-3R 5-AAT GAG CCA AGC TGG TTA AGC T-3534rfbO157F 5-CGG ACA TCC ATG TGA TAT GG-3R 5-TTG CCT ATG TAC AGC TAA TCC-3259116.1模板DNA提取：用热裂解法，将纯化的可疑菌株接种5 mL营养肉汤，36 1 培养6 h或过夜，10 000 r/min离心5 min，弃上清；加入1 mL生理盐水，震荡分散细菌，10 000 r/min离心5 min，弃上清；沉淀加

27、100 L无菌蒸馏水，重新震荡悬浮后置100 水浴10 min；10 000 r/min离心5 min，上清用于PCR扩增。阳性和阴性对照分别为我们保存的产志贺氏毒素1和2的大肠埃希氏菌O157:H7和不具备上述6种基因的大肠埃希氏菌，同法制备。116.2多重PCR反应体系：模板DNA提取液 5 L，10PCR 缓冲液5 L，分别加终浓度1.5 mMMgCl2，0.2 mM dNTP，每种引物500 nM，Taq DNA聚合酶1.5 L，最后加无菌蒸馏水至总体积50 L。116.3多重PCR反应条件：除变性温度由95 改为94 和增加最后72 延伸外，均按Paton法。110循环，94 1 min变性；65 2 min退火；72 1.5 min延伸。1125循环，94 1 min；60 2 min；72 1.5 min。2635循环，94 1 min；65 2 min；72 2.5 min。最后72 10 min。116.4扩增产物用含EB（0.5 g/mL）的2%琼脂糖电泳，阳阴性对照正常，紫外灯下观察结果，照相记录。（六） 副溶血性弧菌检验操作程序117范围本程序规定了粪便标本中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验方法。118检验程序副溶血性弧菌检验程序见图4。图4副溶血性弧菌检验程序119操作步骤