茯苓多糖口服液药效学试验资料.docx

1、茯苓多糖口服液药效学试验资料茯苓多糖口服液产品资料茯苓多糖口服液药效学试验资料 茯苓是一种传统中药，又是名贵食用真菌。茯苓中含有丰富的 -茯苓聚糖，羧甲基茯苓多糖为-茯苓聚糖改造后的衍生物，我们将其制成茯苓多糖口服液（简称CMP口服液），对其进行了如下实验研究。（一） 对免疫功能的影响1、 茯苓多糖口服液对免疫器官重量的影响2、 茯苓多糖口服液对抗体溶血素的影响3、 茯苓多糖口服液对巨噬细胞吞噬功能的影响4、 茯苓多糖口服液对天然杀伤细胞（NK细胞）活性的影响5、 茯苓多糖口服液对肿瘤坏死因子含量的影响6、 茯苓多糖口服液对白细胞介素-2(IL-2)活性的影响（二） 茯苓多糖口服液对肿瘤作用的

2、实验研究1、 对小鼠肉瘤180（S180）的抗癌作用2、 对小鼠爱氏腹水瘤（EAC）的抗癌作用实验材料（一） 药物：茯苓多糖口服液由本院中药所资源室提供，批号930904 80mg/10ml/支，药液浓缩至9.6mg/ml,给药量为120mg，240mg/，相当于临床用量的5、10 倍。（二） 动物：昆明种小鼠，1822g，雌雄各半，由湖南省卫生防疫站动物实验中心提供。昆明种小鼠，1819g，雌雄兼用，由同济医科大学医学动物中心提供。NIH纯种小鼠，200.5g，雌雄兼用，同济医科大学医学动物中心提供。（三） 瘤株：爱氏腹水瘤（EACESC），S180由同济医科大学肿瘤研究室提供。（四） 试剂

3、：环磷酰胺：由上海十二制药厂生产（批号901202）使用当天用生理盐水配成所需浓度75mg/kg，5-Fu：天津和平制药厂生产（批号921004）。豚鼠血清：由湖南生物药厂动物中心提供。SDS：（十二烷基硫化钠）SICMA产品。实验方法与结果（一） 对免疫功能的影响1、 对免疫器官重量的影响：将18-22g小鼠（雌雄兼用）随机分为四组，每组12只动物。生理盐水组和生理盐水加环磷酰胺组，CMP口服液组分别按120mg，240mg/kg灌胃给药，各组灌胃均为等效量体积，除生理盐水组外，所有动物于第7天鸡血红细胞致敏，致敏前后各皮下注射环磷酰胺1次，连续给药10天，次日放血，处死动物，称取胸腺、脾脏

4、重量。结果表明，240mg/kg组与环磷酰胺组比较胸腺、脾脏重量明显增加，经统计学处理，有非常显著性差异。（结果见表I）表：茯苓多糖口服液对小鼠免疫器官重量的影响（ SD）组别剂量（g/kg）动物数（n）体重（g）脏器系数（mg/10g）胸腺脾脏生理盐水25ml1225.53.9874.0118.69106.4323.45生理盐水+Cy25ml1224.632.3528.498.8164.5827.93GMP口服液+Cy1201225.893.9329.307.0757.3421.13CMP口服液+Cy2401223.343.3742.918.09103.4528.98 注：与生理盐水组比“”

5、P0.001 与生理盐水+Cy组比“”P0.01，“”P0.0012、 对抗体溶血素产生的影响分组及给药方法与实验1相同。血清抗鸡红细胞溶血素抗体含量测定按中药药理实验方法学“血清溶血素测定方法”进行。稀释血清加鸡红细胞悬液及稀释豚鼠血清，温育分钟后离心，比色测定光密度。以光密度读数作为判定血清溶血素的指标，比较各组的差异。结果表明，茯苓多糖口服液240mg/kg组光密度值明显升高，与NS+Cy组比，P0.01有非常显著性差异。120mg/kg组与NS+Cy组比光密度略有升高，但无统计学差异。（见表）表：茯苓多糖口服液对抗体溶血素产生的影响（ SD）组别剂量mg/kg动物数nOD值生理盐水25

6、ml120.2600.09NS+Cy25ml120.1300.02CMP口服液+Cy120120.1400.006CMP口服液+Cy240120.1570.02 注：与生理盐水组比：“” P0.001 与NS+Cy组比：“” P0.013、 对腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响：分组及给药方法同前，实验前4天腹腔注射0.5%淀粉生理盐水溶液，每鼠0.5ml，实验时按药理实验方法学中小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验方法进行。实验时每鼠腹腔注射2%鸡RBC悬液1ml，30分钟后，处死动物，剪开腹部皮肤，经腹膜注入NS 2ml，轻揉鼠腹部1分钟，取腹腔液制片，4%（V/V）Giemsa磷酸缓冲液染色计数。表：茯

7、苓多糖口服液对巨噬细胞吞噬功能的影响（ +SD）组别剂量mg/kg动物数n吞噬百分率吞噬指数生理盐水25ml1267.758.721.930.52NS+Cy25ml1240.0811.220.810.31CMP口服液+Cy1201250.4210.091.010.21CMP口服液+Cy2401257.6711.631.510.52 注：与生理盐水组比：“”P0.001 “”P0.05 与NS+Cy组比：“”P0.05 “”P0.01 “”P0.0014、 对NK细胞活性的影响1 对正常动物NK细胞活性的影响选用20-22g昆明种小鼠，随机分为三组，生理盐水组，药物茯苓多糖口服液组120、240

8、ml/kg组给药，各组均为等容量溶液灌胃给药，连续给药12天，末次给药的次日处死动物测定NK细胞的活性。NK细胞活性采用“3H释放法”。颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下制备脾细胞悬液，将细胞调至所需浓度，即为效应细胞（E）悬液。取原制备的靶细胞（T）悬液，E悬液各0.1ml加入96孔u型培养板中，E/T比取100：1，每个样品设三个平行孔。用培养基代替效应细胞作为自然释放，用SDS代替效应细胞作为最大释放。培养板置CO2温箱孵育18hr后，从各孔吸取0.1ml上清液置小塑管中，r计数器测CPM值。结果表明，给药高、低剂量组的NK细胞活性均高于对照组，但无统计学差异。（见表）表:茯苓多糖口服液对正常

9、小鼠NK细胞活性的影响（ SD）组别剂量mg/kg动物数nNK细胞活性（%）生理盐水25ml1155.6719.13CMP口服液1201165.249.63CMP口服液2401267.027.922 对荷瘤动物NK活性的影响取200.5gNIH纯种小鼠40只，雌雄兼用。在每鼠右腋皮下接种EAC瘤细胞2106个细胞。接种后第二天，随机分为4组，每组10只动物，第1组为正常对照组，每只动物每日灌服0.6ml蒸馏水作阴性对照，第2组为5-Fu组，每日灌服15mg/kg作阳性对照，第3、4组为茯苓多糖口服液组，每日灌服剂量依次为100 200mg/kg。给药8日后处死动物，在处死前2日，每日动物腹腔注

10、射6%淀粉肉汤1ml，连续2天，处死动物后应用LDH释放法测定NK细胞活性。无菌取出小鼠脾脏，常规制备脾细胞悬液，最后用完全营养液调整细胞浓度至1107/ml。设NK试验孔、自然释放孔及最大释放孔。用1%的NP-40破坏靶细胞作为最大释放孔。按下表加样于40孔培养板，每个标本设3个复孔。YAC-1细胞效应细胞完全营养液1%NP-40NK试验孔100ul100ul自然释放孔100ul100ul100ul最大释放孔100ul其中YAC-1细胞传代培养2448hr，使用前经洗涤后的完全营养液配成1106/ml，效靶=100：1，效靶混合后，置37 5%CO2孵箱中培养16hr，然后各孔吸取上清液10

11、0ul置96孔培养板中，于37预温，随后每孔加入100ul LDH底物混合液，放室温作用15分钟，加终止反应液后在490nm波长处用酶标检测仪检测各孔的OD值。各孔NK活性值计算如下： 试验孔OD值-自然释入孔OD值NK活性%= 最大释放孔OD值-自然释放孔后实验结果表明，服用茯苓多糖口服液剂量100200mg/kg后，能明显增强荷瘤小鼠NK细胞活性。（见表）表V：茯苓多糖口服液对荷瘤小鼠NK活性的影响（ SD）组别剂量mg/kg动物数nNK细胞活性(%)t值P值阴性对照组1012.011.935-Fu组151016.012.583.880.01CMP口服液1001014.821.883.27

12、0.01CMP口服液2001015.56+3.442.820.055、 对荷瘤动物肿瘤坏死因子含量的影响：荷瘤、分组及给药方法与对荷瘤动物NK细胞活性的影响相同。应用酶联免疫吸附（ELISA）法检测腹腔M 中产生的TNF的含量。1 小鼠腹腔M 中的肿瘤坏死因子（TNF）的诱生a) 小鼠处死前2日，每天腹腔注射6%淀粉肉汤1ml/每只鼠，连续2天。b) 处死小鼠，取腹腔中的M ，洗涤2次，用完全营养液调整细胞浓度至2106/ml。c) 取上述细胞悬液1ml，加入24孔细胞培养板中，贴壁2小时后用RPMI1640洗涤2次，加入终浓度为10ug/ml的LPS，培养16hr后，收集上清液。-20冻存备

13、用。2 TNF含量的测定a) 包板：将抗TNF单抗T和E6（浓度均为1mg/ml）分别取5ul加入1240ul包被缓冲液中，稀释后二种抗体等量混合加入酶标板，每孔50ul，置4过液。b) 封闭：包被好的板经洗涤后，加入封闭液（缓冲液）每孔100ul，37放置30分钟。c) 封闭好的板洗涤后，加入按一定比例稀释（8个梯度）的TNF标准品和待检上清液，每孔50ul，置室温1hr。d) 加一抗：反应后的板经洗涤后，加入1：100稀释的兔抗TNF抗体，每孔50ul室温反应1小时。e) 加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体：上述反应的板经洗涤后加入1：100稀释的酶标记抗体，每孔50ul，室温反应40-60

14、分钟，洗涤。f) 加底物OPD显色：待等比释孔颜色梯度明显时，用2NH2SO4终止反应，在酶联检测仪各孔OD值。已知标准TNF含量与其相应孔OD值呈线性关系。根据所得OD值，经过相关分析，可得各待检孔的相应TNF的含量。结果表明，茯苓多糖口服液能使TNF含量增高。当剂量在200mg/kg时，荷瘤小鼠中的TNF含量与对照组相比明显增高，经统计学处理P0.05。（见表）表：茯苓多糖口服液对荷瘤小鼠TNF含量的影响（ SD）组别剂量mg/kg动物数nTNF含量（105ug/ml）t值P值阴性对照组108.051.465-Fu组151012.284.033.110.05CMP口服液200109.691

15、.422.520.056、 对正常动物白细胞介素-2（IL-2）活性的影响选用20-22g小鼠，随机分为三组，对照组每天灌胃等容量生理盐水，两个给药组分别按120mg/kg，240mg/kg灌胃羧甲基茯苓多糖口服液，连续给药12天后，处死动物，无菌摘取脾脏，进行IL-2依赖细胞株（CTLL2）培养，CTLL2 细胞在培养基中于24孔板中传代。然后再96孔板中稀释标本，稀释度为1：2、1：4、1：6、1：32、1：64，体积0.1ml，每一稀释度2-3个复孔，将CTLL细胞从24孔板中吸入离心管中，加RPMI-1640，20010分钟重复3次洗涤细胞，用含10%小牛血清RPMI-1640调整细胞

16、浓度为1105/ml，将调整好浓度的CTLL细胞加入到已稀释标本的96孔板中，每空0.1ml，轻轻混匀，放到5% CO237培养箱中培养17hr，加入8H-Tdr 0.5uci/孔，继续培养6hr，用多头细胞收集器收获细胞，加入闪烁液，于Beckmen液闪仪上测cpm。以不同稀释度IL-2标本cpm值作直线回归，即用=a+b公式计算IL-2活性单位，用t检验进行组间比较。实验结果表明，茯苓多糖口服液能明显提高IL-2的活性，与对照组相比，有非常显著性差异。（见表）表：茯苓多糖口服液对小鼠IL-2活性的影响（ SD）组别剂量mg/kg动物数nIL-2（刺激指数）生理盐水25ml1123.748.

17、58茯苓多糖口服液1201144.038.26茯苓多糖口服液2401236.9610.65注：与对照组相比：“”P0.01，“”P30%，P0.05，动物死亡数20%，动物体重下降率15%时认为有效，结果见表。表：茯苓多糖口服液对S180瘤株的作用组别剂量mg/kg给药途径疗程（天）动物数（只）始/末体重变化率（%）瘤重（g）（ SD）抑制率（%）生理盐水组25mlP0810/1044.51.340.325-FU组20P0810/1035.350.540.4359.70茯苓多糖口服液100P0810/1054.540.480.3464.17茯苓多糖口服液200P0810/1045.580.70

18、0.3647.76茯苓多糖口服液300P0810/1035.540.510.5361.94注：与对照组相比：“”P0.05，“”P0.01第一次重复试验，分组，剂量，给药时间均与上同，结果见表表：茯苓多糖口服液对S180瘤株的作用组别剂量mg/kg给药途径疗程（天）动物数（只）始/末体重变化率（%）瘤重（g）（ SD）抑制率（%）生理盐水组25mlP0810/1032.51.300.225-FU组20P0810/1021.980.670.1448.26茯苓多糖口服液100P0810/1014.860.540.1258.61茯苓多糖口服液200P0810/1037.410.780.1440.07

19、茯苓多糖口服液300P0810/1029.490.740.1643.08注：与对照组相比：“”P0.05，“”P0.01第二次重复试验，分组，给药时间均与上同。给药组灌胃茯苓多糖口服液分别为150、300mg/kg。阴性对照组，5-Fu阳性对照组给药同前。结果见表。表：茯苓多糖口服液对S180瘤株的作用组别剂量mg/kg给药途径疗程（天）动物数（只）始/末体重变化率（%）瘤重（g）（ SD）抑制率（%）生理盐水组25mlP0810/1031.941.590.635-FU组20P0810/10-1.00.3750.2176.4茯苓多糖口服液150P0810/1031.221.170.4726.7

20、茯苓多糖口服液300P0810/1039.31.150.2028.0注：“”P0.01，与对照组相比以上实验表明：口服茯苓多糖口服液100300mg/kg 8天，对小鼠肉瘤S180的抑制率分别为64.17%40.07%，经统计学处理均有显著的抗癌作用。2、 对EAC腹水型瘤株的作用。荷瘤分组，给药时间均与对S180瘤株的作用相同。给药组分别按150mg、300mg/kg灌胃茯苓多糖口服液，阴性对照组给等体积生理盐水，5-Fu阳性对照组按20mg/kg灌胃5-Fu药液。结果见表。表：茯苓多糖口服液对EAC瘤株的作用组别剂量mg/kg给药途径疗程（天）动物数（只）始/末体重变化率（%）瘤重（g）（

21、 SD）抑制率（%）生理盐水组25mlP0810/1019.151.060.165-FU组20P0810/1000.450.1657.45茯苓多糖口服液150P0810/1015.50.430.1859.81茯苓多糖口服液300P0810/1015.630.540.2149.06注：与对照组相比：“”P0.05 “”P0.01重复一次试验，分组，给药时间均与上同。给药组分别按300mg/kg，600mg/kg灌胃口服液，阴性对照组及5-Fu阳性对照组给药同前。结果见表表：茯苓多糖口服液对EAC瘤株的作用组别剂量mg/kg给药途径疗程（天）动物数（只）始/末体重变化率（%）瘤重（g）（ SD）抑

22、制率（%）生理盐水组25mlP0810/1014.411.020.155-FU组20P0810/103.580.410.1959.80茯苓多糖口服液300P0810/1015.610.620.2539.70茯苓多糖口服液600P0810/10-8.80.510.2849.90注：与对照组比较 “”P0.05，“”P0.01以上实验表明，口服茯苓多糖口服液150600mg/kg 8天，对EAC的抑制率分别为39.7059.81%，经统计学处理，具有明显的抗癌作用。小结一、 环磷酰胺可使小鼠胸腺、脾脏的重量，产生溶血素的水平，巨噬细胞的吞噬能力明显降低。在给环磷酰胺同时，给茯苓多糖口服液则可对抗环

23、磷酰胺的抑制作用，可明显提高小鼠胸腺、脾脏的重量，溶血素抗体含量，巨噬细胞的吞噬功能，大剂量组的作用尤为突出，表明该药在调节机体免疫功能，增强机体自身免疫能力方面有着重要的意义。二、 NK活性细胞是机体的重要免疫监视细胞，在机体第一线防御机制中行使主要功能，他们不经致敏即可直接杀伤多种肿瘤细胞和带病毒细胞，还参与机体对免疫反应的调节。本实验结果说明，服用CMP口服液后能明显增强正常小鼠和荷瘤小鼠NK细胞活性，其作用与剂量相关，随着剂量的增加活性增强。三、 口服茯苓多糖口服液剂量在100mg/kg时，荷瘤小鼠肿瘤坏死因子（TNF）含量与对照组相比较无差异，即对TNF含量无影响。当剂量在200mg

24、/kg时，荷瘤小鼠中的TNF含量与对照组相比，有显著性差异。说明茯苓多糖口服液对荷瘤小鼠的TNF有影响，TNF含量随剂量增加而增加，即TNF含量与剂量相关。四、 白细胞介素-2（IL-2）的研究起来越引起人们的重视。它是重要的细胞因子，在免疫与炎症反应中均有重要的作用。它可以诱导T杀伤细胞，为肿瘤治疗提供新的手段。本实验结果说明，茯苓多糖口服液能明显提高正常小鼠IL-2的活性。五、 茯苓多糖口服液对两种动物移植性肿瘤有不同程度的抑制作用。该口服液对S180，EAC两种瘤株的抑制作用与口服5-Fu一样具有抑制作用。而抑制作用与剂量有关，使用剂量在100600mg/kg为宜,本口服液毒性较低，长期服用对动物体重无影响。综上所述，茯苓多糖口服液具有提高机体免疫功能，抗肿瘤的作用，故该口服液将成为疗效好，毒副作用低的保健新药。参考文献1. 徐叔云主编药理实验方法学人民卫生出版社 19922. 李仪奎，等主编中药药理实验方法学上海科技出版社 19923. 张罗修主编免疫药理学上海医科大学出版社 19904. 湖南医科大学免疫学实验指导研究生用课题组长：高顺国 设计者：徐琳本负 责 人：徐琳本 参加者：徐琳本 樊湘红原始资料保存处：湖南省中医药研究员中药所重点实验室试验日期：1993.101994.4 原始资料保存人：徐琳本