茯苓多糖口服液药效学试验资料.docx
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茯苓多糖口服液药效学试验资料
茯苓多糖口服液产品资料
茯苓多糖口服液药效学试验资料
茯苓是一种传统中药，又是名贵食用真菌。
茯苓中含有丰富的β-茯苓聚糖，羧甲基茯苓多糖为β-茯苓聚糖改造后的衍生物，我们将其制成茯苓多糖口服液（简称CMP口服液），对其进行了如下实验研究。
（一）对免疫功能的影响
1、茯苓多糖口服液对免疫器官重量的影响
2、茯苓多糖口服液对抗体溶血素的影响
3、茯苓多糖口服液对巨噬细胞吞噬功能的影响
4、茯苓多糖口服液对天然杀伤细胞（NK细胞）活性的影响
5、茯苓多糖口服液对肿瘤坏死因子含量的影响
6、茯苓多糖口服液对白细胞介素-2（IL-2）活性的影响
（二）茯苓多糖口服液对肿瘤作用的实验研究
1、对小鼠肉瘤180（S180）的抗癌作用
2、对小鼠爱氏腹水瘤（EAC）的抗癌作用
实验材料
（一）药物：
茯苓多糖口服液由本院中药所资源室提供，批号93090480mg/10ml/支，药液浓缩至9.6mg/ml,给药量为120mg，240mg/㎏，相当于临床用量的5、10倍。
（二）动物：
昆明种小鼠，18～22g，雌雄各半，由湖南省卫生防疫站动物实验中心提供。
昆明种小鼠，18～19g，雌雄兼用，由同济医科大学医学动物中心提供。
NIH纯种小鼠，20±0.5g，雌雄兼用，同济医科大学医学动物中心提供。
（三）瘤株：
爱氏腹水瘤（EAC～ESC），S180由同济医科大学肿瘤研究室提供。
（四）试剂：
环磷酰胺：
由上海十二制药厂生产（批号901202）使用当天用生理盐水配成所需浓度75mg/kg，
5-Fu：
天津和平制药厂生产（批号921004）。
豚鼠血清：
由湖南生物药厂动物中心提供。
SDS：
（十二烷基硫化钠）SICMA产品。
实验方法与结果
（一）对免疫功能的影响
1、对免疫器官重量的影响：
将18-22g小鼠（雌雄兼用）随机分为四组，每组12只动物。
生理盐水组和生理盐水加环磷酰胺组，CMP口服液组分别按120mg，240mg/kg灌胃给药，各组灌胃均为等效量体积，除生理盐水组外，所有动物于第7天鸡血红细胞致敏，致敏前后各皮下注射环磷酰胺1次，连续给药10天，次日放血，处死动物，称取胸腺、脾脏重量。
结果表明，240mg/kg组与环磷酰胺组比较胸腺、脾脏重量明显增加，经统计学处理，有非常显著性差异。
（结果见表I）
表Ⅰ：
茯苓多糖口服液对小鼠免疫器官重量的影响（±SD）
组别
剂量
（g/kg）
动物数
（n）
体重
（g）
脏器系数（mg/10g）
胸腺
脾脏
生理盐水
25ml
12
25.5±3.98
74.01±18.69
106.43±23.45
生理盐水+Cy
25ml
12
24.63±2.35
28.49±8.81△△△
64.58±27.93△△△
GMP口服液+Cy
120
12
25.89±3.93
29.30±7.07△△△
57.34±21.13△△△
CMP口服液+Cy
240
12
23.34±3.37
42.91±8.09※※※
103.45±28.98※※
注：
与生理盐水组比“△△△”P<0.001
与生理盐水+Cy组比“※※”P<0.01，“※※※”P<0.001
2、对抗体溶血素产生的影响
分组及给药方法与实验1相同。
血清抗鸡红细胞溶血素抗体含量测定按《中药药理实验方法学》“血清溶血素测定方法”进行。
稀释血清加鸡红细胞悬液及稀释豚鼠血清，温育３０分钟后离心，比色测定光密度。
以光密度读数作为判定血清溶血素的指标，比较各组的差异。
结果表明，茯苓多糖口服液240mg/kg组光密度值明显升高，与NS+Cy组比，P<0.01有非常显著性差异。
120mg/kg组与NS+Cy组比光密度略有升高，但无统计学差异。
（见表Ⅱ）
表Ⅱ：
茯苓多糖口服液对抗体溶血素产生的影响（±SD）
组别
剂量
mg/kg
动物数
n
OD值
生理盐水
25ml
12
0.260±0.09
NS+Cy
25ml
12
0.130±0.02△△△
CMP口服液+Cy
120
12
0.140±0.006△△△
CMP口服液+Cy
240
12
0.157±0.02※※△△△
注：
与生理盐水组比：
“△△△”P<0.001
与NS+Cy组比：
“※※※”P<0.01
3、对腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响：
分组及给药方法同前，实验前4天腹腔注射0.5%淀粉生理盐水溶液，每鼠0.5ml，实验时按《药理实验方法学》中小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验方法进行。
实验时每鼠腹腔注射2%鸡RBC悬液1ml，30分钟后，处死动物，剪开腹部皮肤，经腹膜注入NS2ml，轻揉鼠腹部1分钟，取腹腔液制片，4%（V/V）Giemsa磷酸缓冲液染色计数。
表Ⅲ：
茯苓多糖口服液对巨噬细胞吞噬功能的影响（+SD）
组别
剂量
mg/kg
动物数
n
吞噬百分率
吞噬指数
生理盐水
25ml
12
67.75±8.72
1.93±0.52
NS+Cy
25ml
12
40.08±11.22△△△
0.81±0.31△△△
CMP口服液+Cy
120
12
50.42±10.09△△△※
1.01±0.21△△△
CMP口服液+Cy
240
12
57.67±11.63△※※
1.51±0.52※※※
注：
与生理盐水组比：
“△△△”P〈0.001“△”P〈0.05
与NS+Cy组比：
“※”P〈0.05“※※”P〈0.01
“※※※”P〈0.001
4、对NK细胞活性的影响
1对正常动物NK细胞活性的影响
选用20-22g昆明种小鼠，随机分为三组，生理盐水组，药物茯苓多糖口服液组120、240ml/kg组给药，各组均为等容量溶液灌胃给药，连续给药12天，末次给药的次日处死动物测定NK细胞的活性。
NK细胞活性采用“3H释放法”。
颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下制备脾细胞悬液，将细胞调至所需浓度，即为效应细胞（E）悬液。
取原制备的靶细胞（T）悬液，E悬液各0.1ml加入96孔u型培养板中，E/T比取100：
1，每个样品设三个平行孔。
用培养基代替效应细胞作为自然释放，用SDS代替效应细胞作为最大释放。
培养板置CO2温箱孵育18hr后，从各孔吸取0.1ml上清液置小塑管中，r计数器测CPM值。
结果表明，给药高、低剂量组的NK细胞活性均高于对照组，但无统计学差异。
（见表Ⅳ）
表Ⅳ:
茯苓多糖口服液对正常小鼠NK细胞活性的影响（±SD）
组别
剂量
mg/kg
动物数
n
NK细胞活性
（%）
生理盐水
25ml
11
55.67±19.13
CMP口服液
120
11
65.24±9.63
CMP口服液
240
12
67.02±7.92
2对荷瘤动物NK活性的影响
取20±0.5gNIH纯种小鼠40只，雌雄兼用。
在每鼠右腋皮下接种EAC瘤细胞2×106个细胞。
接种后第二天，随机分为4组，每组10只动物，第1组为正常对照组，每只动物每日灌服0.6ml蒸馏水作阴性对照，第2组为5-Fu组，每日灌服15mg/kg作阳性对照，第3、4组为茯苓多糖口服液组，每日灌服剂量依次为100200mg/kg。
给药8日后处死动物，在处死前2日，每日动物腹腔注射6%淀粉肉汤1ml，连续2天，处死动物后应用LDH释放法测定NK细胞活性。
无菌取出小鼠脾脏，常规制备脾细胞悬液，最后用完全营养液调整细胞浓度至1×107/ml。
设NK试验孔、自然释放孔及最大释放孔。
用1%的NP-40破坏靶细胞作为最大释放孔。
按下表加样于40孔培养板，每个标本设3个复孔。
YAC-1细胞
效应细胞
完全营养液
1%NP-40
NK试验孔
100ul
100ul
自然释放孔
100ul
100ul
100ul
最大释放孔
100ul
其中YAC-1细胞传代培养24～48hr，使用前经洗涤后的完全营养液配成1×106/ml，效靶=100：
1，效靶混合后，置37℃5%CO2孵箱中培养16hr，然后各孔吸取上清液100ul置96孔培养板中，于37℃预温，随后每孔加入100ulLDH底物混合液，放室温作用15分钟，加终止反应液后在490nm波长处用酶标检测仪检测各孔的OD值。
各孔NK活性值计算如下：
试验孔OD值-自然释入孔OD值
NK活性%=————————————————×１００％
最大释放孔OD值-自然释放孔后
实验结果表明，服用茯苓多糖口服液剂量100～200mg/kg后，能明显增强荷瘤小鼠NK细胞活性。
（见表Ⅴ）
表V：
茯苓多糖口服液对荷瘤小鼠NK活性的影响（±SD）
组别
剂量
mg/kg
动物数
n
NK细胞活性
（%）
t值
P值
阴性对照组
10
12.01±1.93
5-Fu组
15
10
16.01±2.58
3.88
<0.01
CMP口服液
100
10
14.82±1.88
3.27
<0.01
CMP口服液
200
10
15.56+3.44
2.82
<0.05
5、对荷瘤动物肿瘤坏死因子含量的影响：
荷瘤、分组及给药方法与对荷瘤动物NK细胞活性的影响相同。
应用酶联免疫吸附（ELISA）法检测腹腔Mψ中产生的TNF的含量。
1小鼠腹腔Mψ中的肿瘤坏死因子（TNF）的诱生
a）小鼠处死前2日，每天腹腔注射6%淀粉肉汤1ml/每只鼠，连续2天。
b）处死小鼠，取腹腔中的Mψ，洗涤2次，用完全营养液调整细胞浓度至2×106/ml。
c）取上述细胞悬液1ml，加入24孔细胞培养板中，贴壁2小时后用RPMI1640洗涤2次，加入终浓度为10ug/ml的LPS，培养16hr后，收集上清液。
-20℃冻存备用。
2TNF含量的测定
a）包板：
将抗TNF单抗Tδ和E6（浓度均为1mg/ml）分别取5ul加入1240ul包被缓冲液中，稀释后二种抗体等量混合加入酶标板，每孔50ul，置4℃过液。
b）封闭：
包被好的板经洗涤后，加入封闭液（缓冲液）每孔100ul，37℃放置30分钟。
c）封闭好的板洗涤后，加入按一定比例稀释（8个梯度）的TNF标准品和待检上清液，每孔50ul，置室温1hr。
d）加一抗：
反应后的板经洗涤后，加入1：
100稀释的兔抗TNF抗体，每孔50ul室温反应1小时。
e）加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体：
上述反应的板经洗涤后加入1：
100稀释的酶标记抗体，每孔50ul，室温反应40-60分钟，洗涤。
f）加底物OPD显色：
待等比释孔颜色梯度明显时，用2NH2SO4终止反应，在酶联检测仪各孔OD值。
已知标准TNF含量与其相应孔OD值呈线性关系。
根据所得OD值，经过相关分析，可得各待检孔的相应TNF的含量。
结果表明，茯苓多糖口服液能使TNF含量增高。
当剂量在200mg/kg时，荷瘤小鼠中的TNF含量与对照组相比明显增高，经统计学处理P<0.05。
（见表Ⅵ）
表Ⅵ：
茯苓多糖口服液对荷瘤小鼠TNF含量的影响（±SD）
组别
剂量
mg/kg
动物数
n
TNF含量
（×105ug/ml）
t值
P值
阴性对照组
—
10
8.05±1.46
5-Fu组
15
10
12.28±4.03
3.11
<0.05
CMP口服液
100
10
8.50±2.53
0.48
>0.05
CMP口服液
200
10
9.69±1.42
2.52
<0.05
6、对正常动物白细胞介素-2（IL-2）活性的影响
选用20-22g小鼠，随机分为三组，对照组每天灌胃等容量生理盐水，两个给药组分别按120mg/kg，240mg/kg灌胃羧甲基茯苓多糖口服液，连续给药12天后，处死动物，无菌摘取脾脏，进行IL-2依赖细胞株（CTLL2）培养，CTLL2细胞在培养基中于24孔板中传代。
然后再96孔板中稀释标本，稀释度为1：
2、1：
4、1：
6、1：
32、1：
64，体积0.1ml，每一稀释度2-3个复孔，将CTLL细胞从24孔板中吸入离心管中，加RPMI-1640，200×10分钟重复3次洗涤细胞，用含10%小牛血清RPMI-1640调整细胞浓度为1×105/ml，将调整好浓度的CTLL细胞加入到已稀释标本的96孔板中，每空0.1ml，轻轻混匀，放到5%CO237℃培养箱中培养17hr，加入8H-Tdr0.5uci/孔，继续培养6hr，用多头细胞收集器收获细胞，加入闪烁液，于Beckmen液闪仪上测cpm。
以不同稀释度IL-2标本cpm值作直线回归，即用ｙ=a+b×公式计算IL-2活性单位，用t检验进行组间比较。
实验结果表明，茯苓多糖口服液能明显提高IL-2的活性，与对照组相比，有非常显著性差异。
（见表Ⅶ）
表Ⅶ：
茯苓多糖口服液对小鼠IL-2活性的影响（±SD）
组别
剂量
mg/kg
动物数
n
IL-2
（刺激指数）
生理盐水
25ml
11
23.74±8.58
茯苓多糖口服液
120
11
44.03±8.26※※※
茯苓多糖口服液
240
12
36.96±10.65※※
注：
与对照组相比：
“※※”P<0.01，“※※※”P<0.001
（二）抗肿瘤的实验研究
1、对大鼠肉瘤S180的作用
取S180菌株，以生理盐水稀释至0.2ml中含5×106细胞数。
接种到每只大鼠右前肢腋下，然后随机分为5组，每组10只动物。
第1组为阴性对照组，每天灌胃等容量NS，第2组为5-Fu阳性对照组按20mg/kg灌胃5-Fu药液；第3、4、5组为茯苓多糖口服组，分别按100、200、300mg/kg灌胃药液在接种后24hr给药，每天一次，按常规求出肿瘤抑制率。
当抑制率>30%，P<0.05，动物死亡数<20%，动物体重下降率<15%时认为有效，结果见表Ⅷ。
表Ⅷ：
茯苓多糖口服液对S180瘤株的作用
组别
剂量
mg/kg
给药途径
×疗程（天）
动物数（只）
始/末
体重变化率（%）
瘤重（g）
（±SD）
抑制率
（%）
生理盐水组
25ml
P0×8
10/10
44.5
1.34±0.32
5-FU组
20
P0×8
10/10
35.35
0.54±0.43
59.70※※
茯苓多糖口服液
100
P0×8
10/10
54.54
0.48±0.34
64.17※※
茯苓多糖口服液
200
P0×8
10/10
45.58
0.70±0.36
47.76※
茯苓多糖口服液
300
P0×8
10/10
35.54
0.51±0.53
61.94※※
注：
与对照组相比：
“※”P<0.05，“※※”P<0.01
第一次重复试验，分组，剂量，给药时间均与上同，结果见表Ⅸ
表Ⅸ：
茯苓多糖口服液对S180瘤株的作用
组别
剂量
mg/kg
给药途径
×疗程（天）
动物数（只）
始/末
体重变化率（%）
瘤重（g）
（±SD）
抑制率
（%）
生理盐水组
25ml
P0×8
10/10
32.5
1.30±0.22
5-FU组
20
P0×8
10/10
21.98
0.67±0.14
48.26※
茯苓多糖口服液
100
P0×8
10/10
14.86
0.54±0.12
58.61※※
茯苓多糖口服液
200
P0×8
10/10
37.41
0.78±0.14
40.07※
茯苓多糖口服液
300
P0×8
10/10
29.49
0.74±0.16
43.08※
注：
与对照组相比：
“※”P<0.05，“※※”P<0.01
第二次重复试验，分组，给药时间均与上同。
给药组灌胃茯苓多糖口服液分别为150、300mg/kg。
阴性对照组，5-Fu阳性对照组给药同前。
结果见表Ⅹ。
表Ⅹ：
茯苓多糖口服液对S180瘤株的作用
组别
剂量
mg/kg
给药途径
×疗程（天）
动物数（只）
始/末
体重变化率（%）
瘤重（g）
（±SD）
抑制率
（%）
生理盐水组
25ml
P0×8
10/10
31.94
1.59±0.63
5-FU组
20
P0×8
10/10
-1.0
0.375±0.21
76.4※※
茯苓多糖口服液
150
P0×8
10/10
31.22
1.17±0.47
26.7
茯苓多糖口服液
300
P0×8
10/10
39.3
1.15±0.20
28.0
注：
“※※”P<0.01，与对照组相比
以上实验表明：
口服茯苓多糖口服液100～300mg/kg8天，对小鼠肉瘤S180的抑制率分别为64.17%～40.07%，经统计学处理均有显著的抗癌作用。
2、对EAC腹水型瘤株的作用。
荷瘤分组，给药时间均与对S180瘤株的作用相同。
给药组分别按150mg、300mg/kg灌胃茯苓多糖口服液，阴性对照组给等体积生理盐水，5-Fu阳性对照组按20mg/kg灌胃5-Fu药液。
结果见表Ⅺ。
表Ⅺ：
茯苓多糖口服液对EAC瘤株的作用
组别
剂量
mg/kg
给药途径
×疗程（天）
动物数（只）
始/末
体重变化率（%）
瘤重（g）
（±SD）
抑制率
（%）
生理盐水组
25ml
P0×8
10/10
19.15
1.06±0.16
5-FU组
20
P0×8
10/10
0
0.45±0.16
57.45※※
茯苓多糖口服液
150
P0×8
10/10
15.5
0.43±0.18
59.81※
茯苓多糖口服液
300
P0×8
10/10
15.63
0.54±0.21
49.06※
注：
与对照组相比：
“※”P<0.05“※※”P<0.01
重复一次试验，分组，给药时间均与上同。
给药组分别按300mg/kg，600mg/kg灌胃口服液，阴性对照组及5-Fu阳性对照组给药同前。
结果见表Ⅻ
表Ⅻ：
茯苓多糖口服液对EAC瘤株的作用
组别
剂量
mg/kg
给药途径
×疗程（天）
动物数（只）
始/末
体重变化率（%）
瘤重（g）
（±SD）
抑制率
（%）
生理盐水组
25ml
P0×8
10/10
14.41
1.02±0.15
5-FU组
20
P0×8
10/10
3.58
0.41±0.19
59.80※※
茯苓多糖口服液
300
P0×8
10/10
15.61
0.62±0.25
39.70※
茯苓多糖口服液
600
P0×8
10/10
-8.8
0.51±0.28
49.90※
注：
与对照组比较“※”P<0.05，“※※”P<0.01
以上实验表明，口服茯苓多糖口服液150～600mg/kg8天，对EAC的抑制率分别为39.70～59.81%，经统计学处理，具有明显的抗癌作用。
小结
一、环磷酰胺可使小鼠胸腺、脾脏的重量，产生溶血素的水平，巨噬细胞的吞噬能力明显降低。
在给环磷酰胺同时，给茯苓多糖口服液则可对抗环磷酰胺的抑制作用，可明显提高小鼠胸腺、脾脏的重量，溶血素抗体含量，巨噬细胞的吞噬功能，大剂量组的作用尤为突出，表明该药在调节机体免疫功能，增强机体自身免疫能力方面有着重要的意义。
二、NK活性细胞是机体的重要免疫监视细胞，在机体第一线防御机制中行使主要功能，他们不经致敏即可直接杀伤多种肿瘤细胞和带病毒细胞，还参与机体对免疫反应的调节。
本实验结果说明，服用CMP口服液后能明显增强正常小鼠和荷瘤小鼠NK细胞活性，其作用与剂量相关，随着剂量的增加活性增强。
三、口服茯苓多糖口服液剂量在100mg/kg时，荷瘤小鼠肿瘤坏死因子（TNF）含量与对照组相比较无差异，即对TNF含量无影响。
当剂量在200mg/kg时，荷瘤小鼠中的TNF含量与对照组相比，有显著性差异。
说明茯苓多糖口服液对荷瘤小鼠的TNF有影响，TNF含量随剂量增加而增加，即TNF含量与剂量相关。
四、白细胞介素-2（IL-2）的研究起来越引起人们的重视。
它是重要的细胞因子，在免疫与炎症反应中均有重要的作用。
它可以诱导T杀伤细胞，为肿瘤治疗提供新的手段。
本实验结果说明，茯苓多糖口服液能明显提高正常小鼠IL-2的活性。
五、茯苓多糖口服液对两种动物移植性肿瘤有不同程度的抑制作用。
该口服液对S180，EAC两种瘤株的抑制作用与口服5-Fu一样具有抑制作用。
而抑制作用与剂量有关，使用剂量在100～600mg/kg为宜,本口服液毒性较低，长期服用对动物体重无影响。
综上所述，茯苓多糖口服液具有提高机体免疫功能，抗肿瘤的作用，故该口服液将成为疗效好，毒副作用低的保健新药。
参考文献
1.徐叔云主编《药理实验方法学》人民卫生出版社1992
2.李仪奎，等主编《中药药理实验方法学》上海科技出版社1992
3.张罗修主编《免疫药理学》上海医科大学出版社1990
4.湖南医科大学《免疫学实验指导》研究生用
课题组长：
高顺国设计者：
徐琳本
负责人：
徐琳本参加者：
徐琳本樊湘红
原始资料保存处：
湖南省中医药研究员中药所重点实验室
试验日期：
1993.10～1994.4原始资料保存人：
徐琳本
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