分子生物学实验常用试剂配制.docx

1、分子生物学实验常用试剂配制分子生物学实验常用试剂配制(1) 0.01M PBS缓冲液：一袋粉制PBS缓冲液（中杉有售）加1000ml蒸馏水。0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。(2) 0.01M枸橼酸盐缓冲液：一袋粉制枸橼酸盐缓冲液（中杉有售）加1000ml蒸馏水。0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。(3)1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）

2、：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。(4) 1DEPC水：1mlDEPC加入1000ml新鲜三蒸水中，剧烈震荡20分钟使充分混匀，37oC至少放置2h或过夜，HIRAYAMA HV-50高压灭菌器高温高压30分钟降解DEPC，4保存。(5) 1%琼脂糖凝胶：取琼脂糖0.2g置烧杯中，加入20ml的1TAE缓冲液，封闭锥形瓶口，放入微波炉内加热，不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液，待琼脂糖全部熔化后取出摇匀，冷却至60左右，加入10mg/ml溴化乙锭（EB）1l，EB的终浓度为0.5g/ ml，充分混匀。将温热的凝胶倒入已经放好梳子

3、的凝胶槽中，厚度约为3-5mm，注意不要有气泡，将凝胶放置室温待其自然凝固。凝固后从胶槽中轻轻取出梳子。(6)0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml。(7) 50TAE缓冲液：Tris碱242g，17.4mol/L冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA (PH 8.0)100ml加蒸馏水至1000ml。(8) 30%储备胶溶液：溶解29g丙烯酰胺和1g N,N-亚甲基甲叉双丙烯酰胺于双蒸水中，搅拌至充分溶解后，定容至100ml。过滤后于4避光保存。(9) 1.5mo

4、l/L(PH 8.8) Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调PH至8.8，最后用双蒸水定容至100ml。(10) 1.0mol/L(PH 6.8) Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调PH至6.8，最后用双蒸水定容至100ml。(11) 10% SDS：电泳级SDS 10g加双蒸水，68助溶，浓盐酸调PH至7.2，定容至100ml。(12) 10%过硫酸铵（AP）：0.1gAP，加入双蒸水1ml，4保存一周。最好现用现配。(13) 5聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液（PH 8.3）：在900ml双蒸水，加入

5、Tris碱15.2g，待溶解后，加甘氨酸94g，最后加SDS5g，盐酸调PH值到8.3，定容至1000ml。(14) 2SDS加样缓冲液：1mol/L Tris-HCL (PH= 6.8) 1ml，DTT 0.308g，10%SDS 4 ml，溴芬兰0.02g，甘油2ml，定容至10ml。置4避光保存或-20保存。(15) 转膜缓冲液：双蒸水将甘氨酸2.9g，Tris5.8g和SDS 0.37g溶解后，加甲醇200ml，最后定容至1000ml。(16) 0.01MTBS缓冲液：一袋粉制TBS缓冲液加1000ml双蒸水。(17) 漂洗液（TBST缓冲液）：20%Tween1.65ml，加1TBS

6、缓冲液700ml。(18) 考马斯亮蓝G250染液：90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g，用Whatman1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。(19) 考马斯亮蓝洗脱液：90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液。(20) 10丽春红S染液：丽春红0.2g，三氯乙酸3g，磺基水杨酸 3g，加双蒸水至100ml。临用前稀释10倍。(21) 丽春红S染液脱色液：0.01MTBS缓冲液.(22) 封闭液：脱脂奶粉(完达山牌) 5g，加TBST100ml。 RT-PCR实验注意事项：1.由于本实验是检测细胞内mRNA，要防止R

7、NA酶的污染，一旦污染会导致所检测的结果不准确，需要对实验所用材料、器皿等进行灭RNA酶处理。2.实验中所用Eppendorf 管、移液头的处理：1DEPC水浸泡过夜，120高压蒸汽灭菌20分钟。70烤箱内烤干备用；3.实验中所用玻璃器皿的处理：硫酸-重铬酸钾混合液中浸泡24小时，自来水充分冲洗，蒸馏水冲洗，1DEPC水浸泡过夜，120高压蒸汽灭菌20分钟；4.实验中所用金属器皿清洗后，使用前一天经170干烤过夜；橡胶塞经清洗后，120高压蒸汽灭菌20分钟。细胞总RNA的提取（TRIquik Reagent法）(1) 取对数生长期的培养细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化后离心，沉淀加入1.0ml

8、的TRIquik，用枪头抽吸混匀后转移到无菌1.5ml Eppendorf 管中；(2) 将样品在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；(3) 向样品中加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3-5min，使其自然分相；(4) 台式离心机上，12,000rpm，4离心10-15 min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相，把水相转移到新管中；(5)在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，混匀室温放置10-20min；(6)台式离心机上，12,000rpm，4离心10min。去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀；(7

9、)加入1ml75%乙醇（用RNase-free的水配置）洗涤沉淀。每使用1mlTRIquick至少加1ml75%乙醇；(8)47,000rpm离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清；(9)室温放置晾干（不要凉的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干1-2分钟左右即可），加入适量RNase-free水（根据实验需要加入30-100l水），充分溶解RNA；(10)RNA样品-70保存或继续下续实验。总RNA的提取1.上海生工生物技术有限公司UNIQ-10柱式Trizol法(1) 取组织100mg，迅速置于已用DEPC处理过的研钵中，在液氮中将组织研成细粉末，趁液氮尚未挥发光时

10、，将粉末转移到1.5 ml离心管中，加入1.0ml的Trizol，用枪头抽吸混匀；(2) 用1ml 针筒，26-G 号( 4.5)针头抽吸匀浆液15-20 次，以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5ml Eppendorf 管中；(3) 加入100l 氯仿/异戊醇（24：1），剧烈振荡混匀30 秒；(4) 台式离心机上，12,000rpm，室温离心5 分钟；(5) 将上清液(约450l)小心转移到无菌1.5 ml RNase-free 离心管里，加入150l 无水乙醇，混匀；(6) 将上述溶液全部转移到套放于2 ml 收集管内的GenClean 柱中，室温放置2 分钟， 8

11、,000rpm 离心1 分钟；(7) 小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，加入450l RPE Solution，10,000rpm，室温离心30 秒；(8) 重复步骤7 一次；(9) 小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，10,000rpm，室温离心30 秒；(10) 小心取出柱子，放入无菌RNase-free 的1.5 ml 离心管里，在柱内膜的中央小心加入40l DEPCH2O，5580放置2 分钟（室温放置产率约低20%左右）；(11) 8,000rpm，室温离心1 分钟。收集管内的溶液即为RNA 样品，可立即使用或者-70保存。2.Trizol法(1

12、) 取组织100mg，迅速置于已用DEPC处理过的研钵中，在液氮中将组织研成细粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5 ml离心管中，加入1.0ml的Trizol，用枪头抽吸混匀；(2) 用1ml 针筒，26-G 号( 4.5)针头抽吸匀浆液15-20 次，以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5ml Eppendorf 管中；(3) 加入200l氯仿，剧烈震荡混匀30秒；(4)台式离心机上，12000rpm，室温离心5分钟；(5) 将上清液(约450l)小心转移到无菌1.5 ml RNase-free 离心管里，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置5分钟；(6) 台式离心

13、机上，12000rpm，室温离心5分钟；(7)小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失；(8)用70%酒精洗涤两次，每次700l，12000rpm，室温离心2分钟；(9)尽可能的吸走上清液，防止RNA丢失；(10)室温下干燥3-5分钟，使酒精完全挥发；(11)沉淀用30lDEPC-H2O溶解，68放置10分钟；离心管中的溶液即为RNA样品，可立即使用或者-70保存。RT-PCR一、逆转录（RT）获得第一链cDNA(1) 每次RT反应中，按下表加入各组分：总RNA 2lPrimer(0.5g/l)1lRNase-free H2O8l(2) 轻轻混匀，离心35秒 ，70反应5分钟，然后迅速置于冰上5分钟

14、；(3) 顺次加入如下组分：5Reaction Buffer4lRNase Inhibitor(20U/l)1ldNTP Mix(10mmol/L)2l(4) 轻轻混匀，离心3-5秒 ，25反应5分钟；(5) 加入：M-MLV 逆转录酶（20 U/）l1l(6) 轻轻混匀，离心3-5秒 ，25反应10分钟，37反应60分钟，7010分钟终止反应，保存于-20备用或直接用于后续实验。二、PCR反应(1) 50l PCR反应体系： 10PCR Buffer MgCl2 (25mmol/L) 5l3ldNTP Mix (10mmol/L) 5lcDNA 4lSterilized ddH2O30.5l

15、FP1lRP1lTaq DNA polymerase (1U/l) 0.5l总体积50l(2) PCR反应条件：（根据实验所需设定，不同的目的基因反应条件不同）94 4分钟1个循环9415秒40个循环5830秒7290秒72 10分钟1个循环410分钟1个循环(3) PCR琼脂糖凝胶电泳：PCR反应结束后，取5l反应产物与6Loading buffer1l混匀后，微量移液器加入1%的琼脂糖凝胶样品孔中，接通电极，使DNA在100V恒压下向阳极泳动15分钟；(4) 电泳结束后取出凝胶，于BiospectrumAC 凝胶成像分析系统下照相并扫描分析。 Western 印迹1 蛋白样品制备 1.1

16、组织蛋白的提取(1) 将100mg组织块置于1-2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎；(2) 加1000l细胞裂解液于冰上匀浆器中进行匀浆15次。尽量匀浆要碎；(3) 取0.5ml的组织均浆液至一个1.5ml的EP管中；(4) 加1ml抽提试剂液混匀，4静置10分钟，410000 rpm离心5分钟；(5) 弃掉上下层的液体，管内留蛋白膜，开管口，室温10分钟，空气干燥；(6) 加2%的SDS500l溶解后，1003分钟变性。412000 rpm离心5分钟；(7) 取上清分装于200l离心管中并置于-20保存。1.2 考马斯亮兰法检测蛋白浓度(1) 组织匀浆的制备：将新鲜组织用冷

17、生理盐水冲洗血迹，然后用滤纸吸干。准确称取100mg，加100ml生理盐水，用玻璃匀浆器研磨组织，制备成10%的组织匀浆，3000转/分，离心10分钟，然后取组织匀浆上清再用生理盐水按1：9稀释成1%的组织匀浆，或用生理盐水按1：4稀释成2%的匀浆，待测；(2)测定蛋白：空白管标准管测定管蒸馏水（ml）0.050.615g/L标准液（ml）0.05样品（ml）0.05考马斯亮兰显色剂（ml）3.03.03.0混匀各管，静止10分钟，于595nm处，1cm光径，空白管调零，测各管OD值；(3) 计算蛋白浓度：蛋白含量（g/L）=（测定管吸光度/标准管吸光度）标准管浓度（g/L）。1.3 SDS-

18、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(1)将电泳用的玻片清洗干净后，固定在制胶槽上，用水检测制胶槽是否漏水。若不漏即可制胶。(2)制胶1）凝胶的制备分离胶（12%，5ml）积层胶(5%，2ml)ddH2O1.6ml0.4ml30%Acr2.0ml0.33mlBuffer1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 1.3ml1.0mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.25ml10%SDS50l20l10%AP50l20lTEMED2l2l2) 按上述方法配制12分离胶，用5ml注射器吸取5ml迅速将分离胶溶液灌注到电泳仪两层玻璃板之间，留出积层胶空间，加水隔绝空气； 3) 当水

19、和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝。再等3分钟使胶充分凝固，倒去上层水并用滤纸将水吸干；4) 按上述方法配制5的积层胶。将剩余空间灌满积层胶然后将梳子插入积层胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到积层胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出；5) 用水冲洗一下积层胶，将其放入电泳槽中； (3)电泳1) 样品10 l + 2上样buffer 10l共20l，4 12 000 g离心10 分钟。取上清上样； 2) 电泳：积层胶时用80 V恒压电泳，待溴酚兰前沿进入分离胶后，电压改为120 V继续电泳，总时间2小时左右。电泳至溴酚兰达分离胶底部

20、，关电源。1.4 转膜（半干转法）(1) 浸泡PVDF膜：约剪一块与胶大小差不多的PVDF膜浸于无水甲醇溶液中15秒；浸于去离子水中3分钟；浸于转移缓冲液中3分钟。将Whatman滤纸剪的比PVDF膜略小一些，也浸入转移液中。(2) 切胶：将胶卸下，蛋白Marker14-72KD所在凝胶部分行考马斯亮蓝染色，左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按三次滤纸-胶-膜-三次滤纸的顺序制成三明治。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分。(3) 转膜：将上述制好的三明治转移至半干转转膜仪上，负载电压25mv，时间45分钟。1.5封闭将膜从电转槽中取出，先用丽春红染色观察蛋白条带，再用

21、去离子水和TBST将丽春红洗脱后，浸没于5奶粉封闭液中缓慢摇荡一小时。1.6杂交(1) 将膜置于1：300的多克隆兔抗人Cx43抗体2ml或1：1000稀释的抗-actin单克隆抗体中4孵育过夜； (2) 用1TBST在摇床上摇动漂洗膜三次，每次15分钟；。(3) 将膜置于HRP标记的山羊抗兔IgG（1:1000）2ml中室温轻摇孵育2小时；(4) 1TBST摇动漂洗膜三次，每次15分钟；(5) ECL发光试剂盒显影、X片感光后显影定影。清水冲净晾干。1.7结果判定：应用BiospectrumAC 凝胶成像分析系统扫描、用凝胶定量软件Quantity One测定各组目的蛋白和-actin的积分

22、灰度值。数据处理时用各组积分灰度值除以内参照-actin条带的积分灰度值获得相对积分灰度值的比值。细胞基因组DNA的提取动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒法使用前先在漂洗液中加入无水乙醇，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。(1)细胞先用胰酶消化处理，再用预冷的PBS吹打成细胞悬液，取1107个悬浮培养的细胞，然后12000rpm离心1min收集细胞。尽量去除上清，加200l溶液A，振荡至彻底悬浮；(2)向悬浮液中加入20l10mg/ml的RNaseA，55放置15min；(3)加入20l10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，55水浴消化。消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全

23、为止。消化完全的标志是：液体清亮及粘稠；(4)加入200l溶液B，充分混匀；(5)加入200l无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中；(6)12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；(7)向吸附柱中加入700l漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；(8) 向吸附柱中加入500l漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；(9) 12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验；(10)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50200l经75水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min；(11)离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。