生物化学实验报告137030032.docx

1、生物化学实验报告137030032孝感学院生命科学技术学院实验报告专业： 学号： 姓名： 分数：实验二 油脂酸价的测定一、目的与要求 初步掌握测定油脂酸价的原理和方法；了解测定油脂酸价的意义。 二、实验原理 油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质具有刺激性气味，使油脂产生酸价。酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸价或者是酸值来表示。同一油脂若酸价高，则说明水解产生的游离脂肪酸就多。酸价是指中和1g油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。酸价越高，油脂的质量也越差。三、主要仪器、实验材料和试剂1. 锥形瓶（250 mL）3个； 2. 量筒

2、（50 mL）1支；3. 碱式滴定管1支；4. 花生油、菜油、芝麻油等；5. 乙醇-乙醚混合液(1:1,V/V)；6. 0.1 KOH（1克KOH溶于1000 mL纯水中）。四、操作步骤1. 准确称取12 g油脂于250 mL锥形瓶中。2. 在瓶内加入乙醇乙醚混合液50 mL，充分振荡，使油脂样品完全溶解成透明溶液。待油样完全溶解后，加入1酚酞指示剂35滴，立即用0.1 KOH标准溶液滴定至溶液成微红色（放置30 S内不褪色）为终点，并记录用去的KOH的体积，并按下式进行计算。酸价2(V2-V1)/W V2 ：滴定油样时耗用氢氧化钾溶液的毫升数 V1 ：滴定空白对照耗用氢氧化钾溶液的毫升数 W

3、：油样重(g)注：滴定过程中如出现混浊或分层，表明由碱液带进水过多，乙醇量不足以使乙醚与碱溶液互溶。一旦出现此现象，可补加乙醇，促使均一相体系的形成。 五、实验结果油脂名称起始刻度终点刻度体积 （ mL）酸价备注空白对照六、思考题请对你的实验结果进行分析。 批阅教师： 年 月 日 孝感学院生命科学技术学院实验报告专业： 学号： 姓名： 分数：实验三 蛋白质的提取及浓度测定(紫外吸收法)一、目的与要求掌握蛋白质的提取方法；学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。二、实验原理大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等

4、有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。三、实验材料、主要仪器和试剂1. 试验材料：萌发3天的小麦种子 2. 主要仪器（1）紫外分光光度计，（2）离心机（3）试管与试管架，（4）刻度吸量管 （5）研钵 （6）100 mL容量瓶3试剂：标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/ mL（0.5克标准牛血清蛋白纯水定容至500 mL）的溶液。四、操作

5、步骤1蛋白质（淀粉酶）的提取称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取1520 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3,000 r/min转速下离心10 min，将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为蛋白质原液，用于蛋白质浓度的测定。2. 标准曲线制作按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1 cm的石英比色杯，在280 nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出

6、标准曲线。批阅教师： 年 月 日表1 蛋白质标准曲线制作管号标准蛋白质溶液（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（mg/mL）OD280nm104020.53.50.12531.03.00.2541.52.50.37552.02.00.5062.51.50.62573.01.00.7584.001.03.样品测定取提取的蛋白质溶液，按上述方法测定280 nm的光密度，并从标准工作曲线上查出提取蛋白质溶液的浓度。若提取蛋白质溶液的浓度大于2.0，超出测量范围，则稀释后再测，计算蛋白质浓度时乘以稀释倍数。蛋白质浓度=五、思考题1. 为何要在280 nm波长下测定蛋白质浓度？在其它波长下测定可以吗？2.

7、如果考虑核酸的存在，蛋白质浓度的实际的值比测量值是大还是小？为什么？孝感学院生命科学技术学院实验报告专业： 学号： 姓名： 分数：实验四 淀粉酶活力的测定一、目的与要求学习和掌握测定淀粉酶（包括-淀粉酶和-淀粉酶）活力的原理和方法。二、实验原理淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括-淀粉酶和-淀粉酶两种。-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一

8、分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在70 15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝

9、化-淀粉酶，测出-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶活力+-淀粉酶活力），再减去-淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料萌发的小麦种子（芽长约1cm）2仪器（1）离心机（2）离心管（3）研钵（4）电炉（5）容量瓶：50mL1, 100mL1（6）恒温水浴（7）20mL具塞刻度试管13（8）试管架（9）刻度吸管：2mL3, 1mL2, 10mL1 （10）分光光度计3试剂（均为分析纯）（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸

10、1g，溶于20 mL 2 mol/L NaOH溶液中，加入50 mL蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100 mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液 A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O72H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5

11、.6的柠檬酸缓冲液中。批阅教师： 年 月 日四、操作步骤1麦芽糖标准曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：表1 麦芽糖标准曲线制作试 剂管 号1234567麦芽糖标准液（mL）00.20.61.01.41.82.0蒸馏水（mL）2.01.81.41.00.60.20麦芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水杨酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0吸光度值摇匀，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20 mL。以1号管作为空白调零点，在540 nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准

12、曲线。2淀粉酶液的制备称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1 cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取1520 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于-淀粉酶活力测定。吸取上述淀粉酶原液10 mL，放入50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。3酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。表2 酶活力测定取样表

13、操 作 项 目 淀粉酶活力测定 -淀粉酶活力测定 - 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6淀粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0 0 0 0钝化-淀粉酶 置70 水浴15min，冷却淀粉酶稀释液（mL） 0 0 0 1.0 1.0 1.03,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 0 0 2.0 0. 0预保温 将各试管和1%淀粉溶液分别置于40恒温水浴中保温10 min1%淀粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0保温 在40恒温水浴中准确保温5min3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0将各试管摇匀，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流

14、水冷却，加蒸馏水定容至20 mL。以1号管（做标准曲线时用过的）作为空白调零点，在540 nm波长下比色测定光密度，记录测定结果。 管号- 1- 2- 3- 4- 5- 6吸光度麦芽糖含量五、结果计算计算- 2、- 3光密度平均值与- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算- 淀粉酶的活力。计算- 5、- 6光密度平均值与- 4光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（）淀粉酶总活力(单位同上)。（）淀粉酶总活力-淀粉酶活力（）淀粉酶总活力-淀粉酶活力六、思考题1为什么要将- 1、- 2、- 3号试管中的淀粉酶原液置70 水浴中保温15m

15、in？2为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40 水浴中保温？ 孝感学院生命科学技术学院实验报告专业： 学号： 姓名： 分数：实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质一、目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。二、原理带电质点在电场中移动的现象称为电泳。电泳有很多类型，如，纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。例如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它

16、们在溶液中会解离而带电。不同的质点在同一电场中泳动速度不同，据此可将不同带电物质分开。 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。三、器材及试剂1器材：醋酸纤维薄膜（28cm）玻璃板常压电泳仪竹镊点样器（盖玻片）白磁反应板培养皿（染色及漂洗用）人血清或鸡血清粗滤纸2试剂：巴比妥缓冲液（PH8.6）：巴比妥2.

17、76克，巴比妥纳15.45克，加水至1000毫升。染色液：氨基黑10B 0.25克，甲醇50毫升，冰醋酸10毫升，水40毫升（可重复用）。漂洗液：含甲醇或乙醇45毫升，冰醋酸5毫升，水50毫升。透明液：含无水乙醇7份，冰醋酸3份。四、操作步骤1浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在无光泽面角上用铅笔做上记号）放在缓冲液中浸泡20分钟。2点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在白磁板上的血清中沾一下，再在膜条一端23厘米处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。批阅教师： 年 月 日

18、+膜条样品3电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。）膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160V，电流强度0.40.7毫安/厘米膜宽，电泳时间约为60分钟。4染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。5漂洗：将膜条从染色液中取出，置漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电

19、泳图谱。6定量（了解）：有两种方法（1）将上述漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下各种蛋白质色带，分别浸于4.0ml 0.4molL-1NaOH溶液中（37）510分钟，色泽浸出后，比色（590nm）。设各部分的光密度分别为：OD白、OD1、OD2、OD、OD。则光密度总和（OD总）为：OD总=OD白+OD1+OD2+OD+OD白蛋白%=100 1球蛋白%=100 2球蛋白%=100球蛋白%=100 球蛋白%=100（2）把薄膜放在滤纸上用电吹风吹干，待薄膜完全干燥后，浸入透明液中约510分钟，取出，平贴于干净玻璃片上，自然干燥或用电吹风冷风吹干，即得背景透明的电泳图谱，可用刀片刮开并从玻板上取下图谱。

20、能用光密度计测定各蛋白斑点。此图谱可长期保存。 五、思考题1点样端为何放在负极？2实验中应注意哪些事项？ 孝感学院生命科学技术学院实验报告专业： 学号： 姓名： 分数：实验六 氨基酸的分离鉴定纸层析法一、实验目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、实验原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：Rf = 原点到层析中心的距离 / 原点到容剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法

21、分离氨基酸。三、器材1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、小烧杯 6、长颈漏斗7、层析滤纸(新华一号) 8、电吹风四、试剂1、扩展剂 正丁醇:88%甲酸:水15:2.5:2.5（体积比），平衡溶剂与扩展剂相同。每组配制40 mL。2、氨基酸溶液 05的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为05)。 3、显色剂 50l00 mL 0.1 水合茚三酮正丁醇溶液。五、操作1将盛有扩展剂10 mL的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。2戴手套取层析滤纸(长22 cm、宽14 cm)一张。在纸的一端距边缘23 cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2.5 cm作一

22、记号。3点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上，干后重复点一次，直径最大不超过3 mm。缝成筒状，两边不能接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约1030分钟。4展层用长颈漏斗，扩展剂的液面需低于点样线1cm。溶剂扩展至滤纸上沿约5厘米时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。5显色用0.1%茚三酮丙酮溶液均匀浸透，用热风吹干。脯氨酸、羟脯氨酸产生黄色物质外，所有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。批阅教师： 年 月 日6计算各种氨基酸的Rf值。六、实验结果 各种氨基酸的Rf值：赖氨酸脯氨酸缬氨酸苯丙氨酸亮氨酸Rf值七、思考题1. 实验过程中切勿用手直接接触滤纸

23、和显色剂，为什么？2. 点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为什么？孝感学院生命科学技术学院实验报告专业： 学号： 姓名： 分数：实验七 基因组DNA的快速提取-碘化钾法一、实验目的了解碘化钾法提取动物组织基因组DNA的原理；掌握DNA提取的相关操作技术。二、实验原理快速、经济地从血液、组织或培养细胞中得到高产量、高纯度的DNA 对于基因研究非常重要。目前国内外基因组DNA 的提取方法有传统的蛋白酶K 消化法、尿素法、氯化锌法、辛酸法等， 这些方法存在操作步骤繁杂或者使用蛋白酶，且国内许多实验室不易得到方法中使用的试剂。 高浓度碘化钾可直接将细胞膜、核膜破坏、使DNA 释放出来，然后用异

24、丙醇沉淀DNA。实验表明，KI 的浓度对DNA 的提取效率有影响，5 mol/ L 的KI 提取DNA 效果较好。KI 法操作简便，不用价格较高的蛋白酶K。DNA 丢失少。该方法提取的DNA 与经典的蛋白酶K 法提取的DNA 比较电泳结果基本一致。三、实验材料、试剂及主要器材1. 实验材料冷冻的新鲜动物肝脏。2. 试剂氯仿/异戊醇（241）:异戊醇21 mL加入到500 mL的氯仿试剂瓶中，混匀；5 mol/L 碘化钾：（41.5克碘化钾溶于50 mL纯水中）；0. 9 % NaCl：4.5克NaCl溶于500 mL纯水中；无水乙醇。3. 主要器材台式高速(冷冻)离心机、移液器（10, 100

25、，1000 L），旋涡混合器、Eppendorf管等。四、实验步骤1. 取黄豆粒大小冷冻肝组织于EP管中（EP管上写上自己学号的最后两位数），有眼科剪捣碎；2. 加50 L 5 mol/ L KI，旋涡振荡30 s，静置3 min；3. 加0. 9 % NaCl 375 L，氯仿/异戊醇(24:1) 600 L，充分振荡10 min，10 000 r/ min 离心5 min ；4. 吸取水相层(上清)于另一Ependorf 管中，加-20度预冷乙醇1000 L，轻轻混匀（此时应能看到DNA的絮状沉淀），12 000 r/ min 离心5 min 弃上清；5. 加冷无水乙醇1000 L，12，

26、000 r/ min 离心3 min 弃净乙醇，待干（可在37 烘干约10 min）；以50 L无菌双蒸水溶解DNA ，备用。2. 加50 L 5 mol/ L KI ，旋涡振荡30 s，将沉淀物混匀3 min；3. 加0. 9 % NaCl 250 L，氯仿/异戊醇(241) 375 L，充分振荡10 min ，10 000 r/ min 离心5 min ；4. 吸取水相层(上清)于另一Ependorf 管中，加-20度预冷乙醇（-20度）300 L，轻轻混匀（此时应能看到DNA的絮状沉淀），-20度冰箱静置5 min后12 000 r/ min 离心5 min 弃上清；批阅教师： 年 月

27、日5. 加冷无水乙醇1000 L，12，000 r/ min 离心3 min 弃净乙醇，待干（可在37烘干约10 min）；以50 L无菌双蒸水溶解DNA ，备用。五、思考题1）在DNA 提取过程中乙醇的作用是什么？为什么用-20度预冷的乙醇效果更好？2）实验所用的EP管和枪头等需要高温灭菌吗，为什么？孝感学院生命科学技术学院实验报告专业： 学号： 姓名： 分数：实验 八 琼脂糖凝胶电泳技术DNA样品检测一、实验目的学习与掌握琼脂糖凝胶电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA含量以及分子量，分离不同大小DNA片段。二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶为支撑物的区带电泳。不同大小、不同形

28、状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。 三、试剂配制1. 5TBE：Tris 54g；硼酸27.5g；0.5 M EDTA（pH 8.0）20 mL；加双蒸水至1 L。用时5倍稀释。2. EB：用水配制成10 mg/mL的贮存液，分装，避光，4保存（1g溴乙锭于100 mL水中）。3. 6加样buffer：0.25%溴酚蓝；40%（W/V）蔗糖；溶于水中，贮存于4。四、实验操作1. 胶模 水平放置胶模。2. 制胶 量取2

29、00 mL 1TBE 缓冲液倒入三角烧瓶中，称取1.6克琼脂糖加入，在微波炉上加热至全熔（清澈透明）。凝胶加热时间不宜过长，以免蒸干。3. 倒胶 用琼脂糖封好胶模，待凝胶冷至50左右时（手感容器能耐受），缓缓倒入制胶模中，迅速放好梳子。凝胶的厚度在35 mm之间。避免产生气泡，尤其梳子周围不能有气泡，若有气泡，可用吸管小心吸去。4. 凝胶条件 凝胶通常需要在室温中放置030分钟。5. 电泳缓冲液 凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中（点样孔在负极），加入1TBE电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面1 mm。6. 拔梳子 小心移去梳子和隔离板，保持点样孔完整。7. 点样 用移液器取1-2 L配制好的 Loading Buffer，分别与需要电泳的样品或Marker混合(5-10 L)，点样，记录点样次序。注意：每次电泳每块胶需留一孔点DNA marker。加样时Tip头不必插入孔中，可对准加样孔，在孔的上方加样，样品会