蛋白质工程试验室试验手册.docx

1、蛋白质工程试验室试验手册蛋白质纯化实验室实验手册祁超2007年10月第一章 外源基因在大肠杆菌中的表达一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上（一）PCR引物设计的基本原则与PCR反应组分和条件1. PCR引物设计的基本原则（1）引物与靶基因间配对的碱基一般为15-20。（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G + C含量宜在45-55%左右。（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3末端不应有互补链存在。（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。可用计算机进行辅助检索分析。（5）引物3末端一般以单个C或G结尾。2. PCR反应组分和条件

2、PCR反应体系一般选用50 l体积，其中含有：10Reaction buffer，5 l2个引物，各12.5-25 pmol (终浓度各0.25-0.50 mol/L)4种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各200mol/L模板DNA，100 ng左右Taq DNA聚合酶，2.5-3 UPCR反应条件一般为：（1）94，5分钟（2）94变性30-60秒（3）50-55退火30-60秒（4）70-72延伸30-60秒（5）725-10分钟共进行25-35次循环。循环是步骤（2）和（4）(二) 质粒DNA的小量制备1、传统方法（1）用灭菌牙签挑单菌落于3 ml LB培养液

3、中，37培养过夜。（2）在每个EP管中倒入1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心1分钟以收集菌体。（3）将菌体重悬于100 l 4预冷的溶液I中，并加入200 l新配制的溶液II, 盖紧管口，快速颠倒离心管6-7次，然后，冰浴5分钟。（4）加150 l 4预冷的溶液III, 倒置5-6次以混合内容物，然后，冰浴5分钟。（5）12,000 rpm 离心10分钟后，小心吸取上清至另一EP管中。（6）加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置5分钟。（7）12,000 rpm离心5分钟后，移去上清，并用70%乙醇漂洗DNA沉淀。DNA沉淀自然干燥，并溶于20 l 双蒸水或1TE缓冲液

4、 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。2. Promega公司Wizard Plus小量DNA纯化方法-离心方案（适用于产品A1330，A1340，A1460及A1470）（1）12,000 rpm离心1分钟，以沉淀1-10 ml过夜培养物。（2）用250l Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。（3）加250l Cell Lysis Solution，倒置5-6次混合。（4）加10l Alkaline Protease Solution，倒置5-6次混合，室温放置5分钟。（5）加350l Neutraliza

5、tion Solution，倒置5-6次混合。（6）室温，最高转速离心10分钟，回收上清。（7）将离心柱插入收集管中。（8）将上清倒入离心柱中。（9）室温，最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。（10）加750l Wash Solution（加乙醇），最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。（11）重复步骤（10）（用250l Wash Solution）。（12）室温，最高转速离心2分钟。（13）将离心柱插入一个无菌的1.5 ml微量离心管中。（14）在离心柱中加50-100l Nuclease-Free Water，室温，最高转速离心1分钟。（15）D

6、NA溶液保存在-20备用。 (三) 质粒DNA的中量制备1. 在100 ml 含100 g/ml 氨苄青霉素的LB培养液中加入1 ml pET-15b/Novablue甘油菌，37培养过夜；2. 4, 4,000 rpm离心10分钟以收集菌体；在菌体用3 ml 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0) 充分悬浮后，加入6 ml 溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS)，并倒置混合，冰浴5-10分钟；3. 加入4.5 ml 溶液III（60ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml

7、冰乙酸和28.5ml水），轻摇混合，冰浴10分钟；4. 4，12,000 rpm 离心20分钟，小心吸取上清至另一个50 ml离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟；5. 室温，10,000 rpm离心10分钟以沉淀DNA；6. 在沉淀用70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于0.3 ml 的TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 缓冲液中，然后转入EP管中；7. 加入等体积的5 mol/L LiCl, 室温，10,000 rpm离心10分钟以沉淀大分子RNA分子；8. 回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，12,000 rp

8、m 离心5分钟以沉淀DNA；9. DNA沉淀用70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；10. DNA沉淀溶于200 l含50-100 g/ml 胰RNA酶的TE缓冲液中，在37保温30分钟；11. 加入等体积的13% PEG8000/1.6 mol/L NaCl, 室温放置5分钟；12,000 rpm 离心10分钟以沉淀DNA；12. 小心移去上清，DNA沉淀溶于200 l TE (pH 8.0) 缓冲液中，并用酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提一次；小心将上层溶液转移到一个干净的EP管中，并加入0.1体积的3mol/L NaAc (pH 5.2)和2倍无水乙醇，混匀，-40放置30分钟；13.

9、12,000 rpm 离心5分钟以沉淀DNA；DNA沉淀用70%的乙醇漂洗，自然干燥，并溶于100 l TE 缓冲液中。最后，用1%的琼脂糖凝胶电泳对DNA进行定量和纯度鉴定。（四）DNA（PCR产物或质粒）的酶切 1. 一般在15-20 l体积中酶切0.2-1 g的DNA，可根据实际情况，按比例放大酶切反应的体积和DNA的量。 2. 一般用7-8 u的限制性内切酶酶切1 g的DNA，酶:DNA的比率应小于25u/g，以防止star activity。 3. 限制性内切酶一般保存在50%的甘油中，而大于5%的甘油可能会引起star activity或抑制酶切反应。因此，在酶切反应体系中，甘油的

10、浓度一般应小于5%，也就是说，限制性内切酶的体积应小于酶切反应总体积的1/10。 4. 对于双酶切反应，可考虑在同一种缓冲液中进行，一般要求任一一种限制性内切酶的活性不低于其最大活性的50%。 5. 酶切反应的时间一般为2-3小时。如果酶切不完全，可适当延长酶切反应的时间。（五）从琼脂糖凝胶或PCR反应物中回收DNA （用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System适用于产品A9280、A9281及A9282）1. 从琼脂糖凝胶中切下含DNA的胶条，并放入一洁净的EP管中。按每10 mg胶条加10 l的Membrane Binding Solu

11、tion，漩涡震荡，并在50-60保温直到胶条完全溶解；对于PCR反应物，可直接加等体积的Membrane Binding Solution混合。2. 将SV 微柱插入收集管中，并将上述溶液加入SV微柱，室温放置1分钟。 3. 10,000 g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。 4. 加700 l Membrane Wash Soluton，10,000 g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。5. 用500 l Membrane Wash Solution 重复步骤4，10,000 g离心5分钟。6. 小心将微柱插入一洁净的EP管中。7. 在微柱中加50 l Nucl

12、ease-Free Water，室温放置1分钟，10,000 g离心1分钟。8. 丢弃微柱，将DNA储存在4或-20。（六）PCR产物或DNA酶切片断与质粒载体的连接1. 常规方法一般在10l反应体系中，加酶切并回收的质粒载体50-100 g左右及1 l的T4 DNA连接酶（3-5 u/l），按PCR产物或DNA酶切片断摩尔数与载体摩尔数比约为3:1的比例进行连接。连接反应在13-16保温过夜。2. 快速连接方法可以通过连接Kit进行。例如，对于Takara公司的连接Kit，可在载体与插入片段的混合液（5 l）中加入5 l Kit溶液，16 保温2小时即可。（七）大肠杆菌感受态细胞的制备1.

13、单菌落接种于3 ml LB培养液中，37过夜培养。2. 取2 ml 过夜培养物接种于200 ml LB培养液中，并且，当37培养至OD600为0.4左右时，转移至250 ml离心管中，立即冰浴30分钟。3. 在4，3,600 rpm离心10分钟，弃上清，加4预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液10 ml, 轻摇以充分悬浮细胞。4. 转移至 50 ml 离心管中，在4，3,500 rpm离心7分钟，小心弃上清。5. 加5 ml 预冷的0.1 mol/L CaCl2 ，轻摇离心管以充分悬浮细胞；冰浴2小时后，加4预冷的80%甘油至终浓度为15%，混匀分装，并保存于-70。（八）用质粒或连接产物

14、转化大肠杆菌感受态细胞1. 常规方法一般用2-3 l连接反应物与200 l 大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴30分钟；42热激90秒，冰浴2分钟；加0.5-0.8 ml 的LB培养液，37，150-200 rpm振荡培养60分钟；低速离心以沉淀细胞，并移去大部分上清；用移液器吹吸混匀细胞，在9 cm 直径的平板涂布100-200 l 细胞悬液，并在37保温过夜。2. 快速转化方法用2-3 l连接反应物与200 l 大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴10分钟，42热激90秒，冰浴2分钟，然后涂布在含有适宜抗生素的平板上。（九）转化子的筛选和鉴定1. 通过Promega公司pGEM-T Vector

15、 System的蓝/白斑筛选（1）在含有适当抗生素90 mm LB琼脂平板中央滴加40 l 2% X-gal（用二甲基甲酰胺配制）和7 l 20% IPTG.。如用150 mm平板，则加100 l 2% X-gal 和 20 l 20% IPTG。（2）用涂布棒使溶液均匀地分散在整个平板的表面。然后，在37保温1小时，使全部液体消失。（3）将pGEM-T Vector-插入片断连接反应物转化的大肠杆菌细胞涂布在上述平板的表面，37保温过夜。其中，白色菌落表明：细胞中的质粒含有插入片断；蓝色菌落表明：细胞中的质粒不含有插入片断。2. 转化子质粒DNA的酶切鉴定用灭菌牙签挑单菌落于3 ml含有适宜抗生素的LB培养液中，37振荡过夜培养。吸取1 ml过夜培养物进行质粒DNA的小量抽提，用限制性内切酶酶切检验质粒DNA中是否有插入片断。3. 以菌落为模板的PCR鉴定用灭菌吸头挑取少许单菌落细胞，点在PCR管的底部。然后，加入其他PCR组分，进行正常的PCR反应（其中，PCR循环前的反应参数为：95保温10分钟），以检测菌落细胞质粒DNA中是否有插入片断。二、Stratagene公司的