蛋白质工程试验室试验手册.docx

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蛋白质工程试验室试验手册

蛋白质纯化实验室

实验手册

祁超

2007年10月

第一章外源基因在大肠杆菌中的表达

一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上

（一）PCR引物设计的基本原则与PCR反应组分和条件

1.PCR引物设计的基本原则

（1）引物与靶基因间配对的碱基一般为15-20。

（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45-55%左右。

（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在。

（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。

可用计算机进行辅助检索分析。

（5）引物3’末端一般以单个C或G结尾。

2.PCR反应组分和条件

PCR反应体系一般选用50μl体积，其中含有：

10×Reactionbuffer，5μl

2个引物，各12.5-25pmol（终浓度各0.25-0.50μmol/L）

4种底物（dATP+dCTP+dGTP+dTTP），各200μmol/L

模板DNA，100ng左右

TaqDNA聚合酶，2.5-3U

PCR反应条件一般为：

（1）94℃，5分钟

（2）94℃变性30-60秒

（3）50-55℃退火30-60秒

（4）70-72℃延伸30-60秒

（5）72℃5-10分钟

共进行25-35次循环。

循环是步骤

（2）和（4）

（二）质粒DNA的小量制备

1、传统方法

（1）用灭菌牙签挑单菌落于3mlLB培养液中，37℃培养过夜。

（2）在每个EP管中倒入1ml左右的过夜培养物，6,000rpm离心1分钟以收集菌体。

（3）将菌体重悬于100μl4℃预冷的溶液I中，并加入200μl新配制的溶液II,盖紧管口，快速颠倒离心管6-7次，然后，冰浴5分钟。

（4）加150μl4℃预冷的溶液III,倒置5-6次以混合内容物，然后，冰浴5分钟。

（5）12,000rpm离心10分钟后，小心吸取上清至另一EP管中。

（6）加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置5分钟。

（7）12,000rpm离心5分钟后，移去上清，并用70%乙醇漂洗DNA沉淀。

DNA沉淀自然干燥，并溶于20μl双蒸水或1×TE缓冲液（10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH8.0）中。

2.Promega公司WizardPlus小量DNA纯化方法-离心方案（适用于产品A1330，A1340，A1460及A1470）

（1）12,000rpm离心1分钟，以沉淀1-10ml过夜培养物。

（2）用250μlCellResuspensionSolution充分悬浮大肠杆菌细胞。

（3）加250μlCellLysisSolution，倒置5-6次混合。

（4）加10μlAlkalineProteaseSolution，倒置5-6次混合，室温放置5分钟。

（5）加350μlNeutralizationSolution，倒置5-6次混合。

（6）室温，最高转速离心10分钟，回收上清。

（7）将离心柱插入收集管中。

（8）将上清倒入离心柱中。

（9）室温，最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。

（10）加750μlWashSolution（加乙醇），最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。

（11）重复步骤（10）（用250μlWashSolution）。

（12）室温，最高转速离心2分钟。

（13）将离心柱插入一个无菌的1.5ml微量离心管中。

（14）在离心柱中加50-100μlNuclease-FreeWater，室温，最高转速离心1分钟。

（15）DNA溶液保存在-20℃备用。

（三）质粒DNA的中量制备

1.在100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中加入1mlpET-15b/Novablue甘油菌，37℃培养过夜；

2.4℃,4,000rpm离心10分钟以收集菌体；在菌体用3ml溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris,pH8.0,10mmol/LEDTA,pH8.0）充分悬浮后，加入6ml溶液II（0.2mol/LNaOH,1%SDS），并倒置混合，冰浴5-10分钟；

3.加入4.5ml溶液III（60ml5mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸和28.5ml水），轻摇混合，冰浴10分钟；

4.4℃，12,000rpm离心20分钟，小心吸取上清至另一个50ml离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟；

5.室温，10,000rpm离心10分钟以沉淀DNA；

6.在沉淀用70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于0.3ml的TE（10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH8.0）缓冲液中，然后转入EP管中；

7.加入等体积的5mol/LLiCl,室温，10,000rpm离心10分钟以沉淀大分子RNA分子；

8.回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，12,000rpm离心5分钟以沉淀DNA；

9.DNA沉淀用70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；

10.DNA沉淀溶于200μl含50-100μg/ml胰RNA酶的TE缓冲液中，在37℃保温30分钟；

11.加入等体积的13%PEG8000/1.6mol/LNaCl,室温放置5分钟；12,000rpm离心10分钟以沉淀DNA；

12.小心移去上清，DNA沉淀溶于200μlTE（pH8.0）缓冲液中，并用酚-氯仿-异戊醇（25:

24:

1）抽提一次；小心将上层溶液转移到一个干净的EP管中，并加入0.1体积的3mol/LNaAc（pH5.2）和2倍无水乙醇，混匀，-40℃放置30分钟；

13.12,000rpm离心5分钟以沉淀DNA；DNA沉淀用70%的乙醇漂洗，自然干燥，并溶于100μlTE缓冲液中。

最后，用1%的琼脂糖凝胶电泳对DNA进行定量和纯度鉴定。

（四）DNA（PCR产物或质粒）的酶切

1.一般在15-20μl体积中酶切0.2-1μg的DNA，可根据实际情况，按比例放大酶切反应的体积和DNA的量。

2.一般用7-8u的限制性内切酶酶切1μg的DNA，酶:

DNA的比率应小于25u/μg，以防止staractivity。

3.限制性内切酶一般保存在50%的甘油中，而大于5%的甘油可能会引起staractivity或抑制酶切反应。

因此，在酶切反应体系中，甘油的浓度一般应小于5%，也就是说，限制性内切酶的体积应小于酶切反应总体积的1/10。

4.对于双酶切反应，可考虑在同一种缓冲液中进行，一般要求任一一种限制性内切酶的活性不低于其最大活性的50%。

5.酶切反应的时间一般为2-3小时。

如果酶切不完全，可适当延长酶切反应的时间。

（五）从琼脂糖凝胶或PCR反应物中回收DNA（用Promega公司的WizardSVGelandPCRClean-UpSystem—适用于产品A9280、A9281及A9282）

1.从琼脂糖凝胶中切下含DNA的胶条，并放入一洁净的EP管中。

按每10mg胶条加10μl的MembraneBindingSolution，漩涡震荡，并在50-60℃保温直到胶条完全溶解；对于PCR反应物，可直接加等体积的MembraneBindingSolution混合。

2.将SV微柱插入收集管中，并将上述溶液加入SV微柱，室温放置1分钟。

3.10,000g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。

4.加700μlMembraneWashSoluton，10,000g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。

5.用500μlMembraneWashSolution重复步骤4，10,000g离心5分钟。

6.小心将微柱插入一洁净的EP管中。

7.在微柱中加50μlNuclease-FreeWater，室温放置1分钟，10,000g离心1分钟。

8.丢弃微柱，将DNA储存在4℃或-20℃。

（六）PCR产物或DNA酶切片断与质粒载体的连接

1.常规方法

一般在10μl反应体系中，加酶切并回收的质粒载体50-100μg左右及1μl的T4DNA连接酶（3-5u/μl），按PCR产物或DNA酶切片断摩尔数与载体摩尔数比约为3:

1的比例进行连接。

连接反应在13-16℃保温过夜。

2.快速连接方法

可以通过连接Kit进行。

例如，对于Takara公司的连接Kit，可在载体与插入片段的混合液（5μl）中加入5μlKit溶液，16℃保温2小时即可。

（七）大肠杆菌感受态细胞的制备

1.单菌落接种于3mlLB培养液中，37℃过夜培养。

2.取2ml过夜培养物接种于200mlLB培养液中，并且，当37℃培养至OD600为0.4左右时，转移至250ml离心管中，立即冰浴30分钟。

3.在4℃，3,600rpm离心10分钟，弃上清，加4℃预冷的0.1mol/LCaCl2溶液10ml,轻摇以充分悬浮细胞。

4.转移至50ml离心管中，在4℃，3,500rpm离心7分钟，小心弃上清。

5.加5ml预冷的0.1mol/LCaCl2，轻摇离心管以充分悬浮细胞；冰浴2小时后，加4℃预冷的80%甘油至终浓度为15%，混匀分装，并保存于-70℃。

（八）用质粒或连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

1.常规方法

一般用2-3μl连接反应物与200μl大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴30分钟；42℃热激90秒，冰浴2分钟；加0.5-0.8ml的LB培养液，37℃，150-200rpm振荡培养60分钟；低速离心以沉淀细胞，并移去大部分上清；用移液器吹吸混匀细胞，在9cm直径的平板涂布100-200μl细胞悬液，并在37℃保温过夜。

2.快速转化方法

用2-3μl连接反应物与200μl大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴10分钟，42℃热激90秒，冰浴2分钟，然后涂布在含有适宜抗生素的平板上。

（九）转化子的筛选和鉴定

1.通过Promega公司pGEM-TVectorSystem的蓝/白斑筛选

（1）在含有适当抗生素90mmLB琼脂平板中央滴加40μl2%X-gal（用二甲基甲酰胺配制）和7μl20%IPTG.。

如用150mm平板，则加100μl2%X-gal和20μl20%IPTG。

（2）用涂布棒使溶液均匀地分散在整个平板的表面。

然后，在37℃保温1小时，使全部液体消失。

（3）将pGEM-TVector--插入片断连接反应物转化的大肠杆菌细胞涂布在上述平板的表面，37℃保温过夜。

其中，白色菌落表明：

细胞中的质粒含有插入片断；蓝色菌落表明：

细胞中的质粒不含有插入片断。

2.转化子质粒DNA的酶切鉴定

用灭菌牙签挑单菌落于3ml含有适宜抗生素的LB培养液中，37℃振荡过夜培养。

吸取1ml过夜培养物进行质粒DNA的小量抽提，用限制性内切酶酶切检验质粒DNA中是否有插入片断。

3.以菌落为模板的PCR鉴定

用灭菌吸头挑取少许单菌落细胞，点在PCR管的底部。

然后，加入其他PCR组分，进行正常的PCR反应（其中，PCR循环前的反应参数为：

95℃保温10分钟），以检测菌落细胞质粒DNA中是否有插入片断。

二、Stratagene公司的