丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及机制.docx

1、丹参酮A对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及机制丹参酮U A对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及机制（作者： 单位： 邮编： ）作者：李浩，刘开祥，俸军林，曾爱源，唐永刚【摘要】 目的探讨丹参酮H A （Tan II A）对缺血再灌注损伤大鼠保护作用及对额顶部皮质中性粒细胞浸润、 自由基含量、能量代谢的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、 Tan I A低剂量治疗组和Tan I A高剂量治疗组，线栓法建立局灶性脑缺血再灌 注模型。Tan IA高、低剂量治疗组于术前连续灌胃给药 3 d，1次/d。用生化法观察缺血90 min再灌注24 h大鼠额顶部皮质髓过氧化 物酶（MPO活性、超氧化物

2、歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA含量、三 磷酸腺苷（ATP含量及脑含水量变化，并进行 2，3，5-三苯基氯 化四氮唑（TTC染色检测脑梗塞体积。结果 Tan I A治疗组脑梗塞 体积较缺血再灌注组减小，高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P0.05）;与缺血再灌注组比较，Tan I A治疗组显著降低MPOS性、 MDA含量，增加SOD、ATP含量，降低脑组织含水量，高、低剂量组 之间差异亦具有显著性（P0.05）。结论Tan I A对缺血再灌注脑损伤 具有保护作用，其机制可能与减轻缺血再灌注损伤炎症反应，减轻氧 化性损伤和改善能量代谢有关。【关键词】 缺血再灌注； 髓过氧化物酶；自由基；三磷酸腺

3、苷；丹参酮HAbstract : ObjectiveTo study the effect of Tanshinone II A(Tan I A) on neutrophils infiltration and the contents of freeradical and ATP in ischemic fron tal and parietal cortex of cerebral ischemia reperfusion ( l/R ) rats.MethodsIn thisexperime nt, rats were ran domly divided in to 4 groups,

4、n amely sham operated group, I/R group,low dose Tan I A treated group and high dose Tan I A treated group. The focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was made by suture-occludedmethod.Rats were pretreated with Tan I A ig for 3d,respectively. After 90min MCAObllowing 24h of reperfusion,th

5、e MPO activity, the contents of SOD and MDA in ischemic frontal and parietal cortex were investigated. TTCstaining wasused to calculate the cerebral infarct volume.ResultsCompared with I/R group,cerebral in farctio n volume in low dose Tan IA treated group and high dose Tan I A treated group decreas

6、ed in a dose-dependent manner (all P0.05). Comparedwith I/R group, low and high dose Tan I A treated groups dose-dependently reduced MPOactivity,the content of MDAand brain water content,in creased the activity of SOD and the content of ATP.ConclusionTan II A may aueviate cerebral ischemia-reperfusi

7、oninjury by decreasing the inflammation reaction , free radicals and the disba nlance of en ergy metabolism.Key words : Ischemia-reperfusion; Myeloperoxidase; Freeradical; ATP ; Tanshinone I A丹参Salvia miltorrhiza Bge为唇形科多年生草本植物，是我国传统具有活血化淤作用的中药，已被广泛用于心脑血管疾病的治疗， 但其作用机制尚不十分清楚。丹参酮（Tanshinone）是丹参的有效活性 组

8、分，其中丹参酮I A （Tanshinone I A, Tan I A） 为丹参酮中含 量最高的活性成分。本实验采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型， 研究丹参酮IA对大鼠脑缺血再灌注损伤缺血区额顶部皮质中性粒细胞浸 润、自由基含量、能量代谢、脑组织含水量及梗塞体积变化的影响， 探讨其对脑再灌注损伤保护作用机制。1材料与方法1.1药品与试剂Tan I A由提供上海第一生化药业有限公司提供， 纯度85%。髓过氧化物酶（MPO,丙二醛（MDA和超氧化物歧化酶（SOD试剂盒 均购于南京建成生物工程研究所。TTC购自中国医药集团上海化学试 剂公司。1.2动物分组及给药方法健康Wistar大鼠，雄性，清洁级，

9、共100只，质量（250士 30） g （广西医科大学动物实验中心提供）。按随机分组原则分成假手术组（25只）、缺血再灌注组（25只）、Tan II A低剂量治疗组（25只） 及Tan I A高剂量治疗组（25只）。Tan低剂量治疗组（15 mg/kg ） 和高剂量治疗组（30 mg/kg ）均于术前连续灌胃给药3 d , 1次/d , 假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水灌胃。第 3天给药后1h建立缺血90 min再灌注24h动物模型。1.3动物模型的建立参照Longa等1的方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。 采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。 线栓采 用石蜡线栓。

10、线栓直径约 0.27 mm,插入深度约18 mm,此时线栓头 位于大脑中动脉起始部。缺血 90 min时，抽提线栓实现再灌注。神 经功能缺陷评分：按照Longa等1评分标准，各组分别在再灌注 24 h进行评分。0分：正常，无神经学征象；1分：动物不能完全神 展右前肢；2分：动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾 现象；3分：动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚； 4分：无自发活动，有意识障碍。神经功能缺陷评分在 13分为模型成功。1.4MPO活性的测定再灌注24h，将大鼠开颅取脑，置于 4C冰箱5 min，在冰浴下 取左侧距离嗅球尖端711 mm之间的额顶部皮质，以试剂盒提供的

11、匀浆介质制成脑组织匀浆。严格按试剂盒说明书步骤要求操作， 计算出MPO舌力单位。1.5MDA和SOD勺测定再灌注24h,将大鼠开颅取脑，置于 4C冰箱5 min，在冰浴下 取左侧距离嗅球尖端711 mm之间的额顶部皮质，以试剂盒提供的 匀浆介质制成脑组织匀浆（步骤和方法同上）。严格按试剂盒说明书 步骤要求操作，计算出MDA和SOD含量。1.6三磷酸腺苷（ATP含量测定再灌注24 h，将大鼠开颅取脑，置于4C冰箱5 min，在冰浴下 取左侧距离嗅球尖端711 mm之间的额顶部皮质，迅速加入乙腈， 混匀，冰浴离心脱蛋白，离心后取上清液水系滤膜过滤后， -86 C保存。用高效液相测定ATP含量。1.

12、7脑含水量检测再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，断头取脑后，快速称取左 右大脑半球湿重，置110115C烤箱内烤至恒重，再分别称其干重， 用（湿重-干重）/湿重的百分比，作为衡量脑含水量指标。1.8 TTC染色再灌注24h，将各组另外5只大鼠深麻后开颅取脑。将鼠脑置于4C冰箱20min后，将其切成5等份冠状位切片，置于2%TTC溶液 中，水浴、多聚甲醛液固定。用计算机病理图像分析仪及梯形法计算 出梗塞灶体积，各脑片梗死灶体积之和即为梗塞体积。 左侧大脑半球 梗死灶区呈白色，主要为额顶部皮质和尾壳核，正常组织呈红色。部 分组织表现为由白色向红色过度区。1.9统计学方法数据处理采用SPSS11.

13、5统计软件进行运算，结果以士 s表 示，组间差异显著性检验米用方差分析。2结果2.1TAN II A对MPOS性的影响结果见表1。假手术组MPO活性呈低水平。缺血再灌注组缺血侧 MPO舌性较假手术组明显升高（P0.05）; TAN I A高、低剂量治疗组 MPOS性较缺血再灌注组明显降低（均 P0.05）;高、低剂量组之间差 异亦具有显著性（P0.05 ）。表 1 TAN I A对 MPO MDA SOD, ATP含 量，脑含水量及脑梗塞体积影响（略）2.2Tan IA对MDA SOD含量的影响缺血再灌注组缺血侧额顶部皮质 SOD含量下降，MDA含量升高， 与假手术组比较，差异具有显著性（P0

14、.05）。Tan I A治疗组可提高 额顶部皮质SOD含量，降低MDA含量，与缺血再灌注组相比较，差异 具有显著性（P0.05）;高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P0.05）。 见表1。2.3Tan IA对ATP含量的影响缺血再灌注组缺血侧额顶部皮质 ATP含量下降，与假手术组比 较，差异具有显著性（P0.05）; Tan IA治疗组ATP含量升高，与缺 血再灌注组相比较，差异具有显著性（P0.05），高、低剂量组之间差 异亦具有显著性（P0.05）。见表1。2. 4 Tan I A对脑水肿的影响缺血再灌注组缺血侧脑组织含水量较假手术组明显升高， 差异具 有显著性（P0.05）; Tan I

15、I A治疗组降低脑组织含水量，与缺血再 灌注组相比差异有显著性（P0.05），高、低剂量组之间差异亦具有显 著性（P0.05）。见表1。2.5Tan IA对脑梗塞体积的影响TTC染色后，缺血再灌注24h左侧大脑半球梗塞灶区呈白色，主 要为额顶部皮质和尾壳核，正常组织呈红色。部分组织表现为由白色 向红色过度区。TTC染色形态学观察显示，用石蜡线栓法制备大鼠局 灶性脑缺血再灌注模型，可使大脑中动脉供血区出现恒定的、 复制性良好的梗塞灶（图1）。Tan I A高、低剂量组梗死体积较缺血再灌 注组显著减小（P0.05）;高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P0.05 ）3讨论何丽娜等2研究发现，丹参酮对

16、原代大鼠神经细胞缺血性损伤有 保护作用。本研究结果也证实，脑缺血再灌注损伤给予Tan I A治疗, 可明显减少减轻再灌注损伤脑水肿及梗塞体积， 对缺血脑组织有保护作用，高剂量GBE勺保护效果更显著。MPO主要存在于中性粒细胞的噬天青颗粒中。 MPC活性反映 中性粒细胞在脑组织中浸润程度。 我们前期研究已证实，脑缺血再灌 注损伤出现了中性粒细胞参与为标志的炎症反应过程，减轻脑缺血再 灌注损伤后炎症反应对缺血脑组织有保护作用 3。本研究结果提示， 脑缺血再灌注损伤给予Tan I A腹腔注射治疗，可明显减少缺血再灌 注后MPC活性，减少中性粒细胞的浸润，对缺血再灌注损伤炎症反应有抑制作用。胡霞敏等4预防性用药给予缺血再灌注损伤大鼠 TanH A治疗，发现Tan II