抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定.docx

1、抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定 吴春风, 马忠森, 王秀丽, 杨俊玲, 杨洋, 张越, 图们乌力吉, 乔俊华【摘要】 目的: 制备抗人DcR3单克隆抗体（mAb）, 并鉴定其特异性。方式: 纯化的His DcR3融合蛋白免疫小鼠, 应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化, 纯化后的抗体经Western blot和ELISA方式鉴定其特异性、 Ig亚型和效价。结果: 取得5株稳固分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞, 均属IgG1亚型, 其腹水抗体效价为110-5110-7, Western blot显示5株细胞分泌的mAb都可识别DcR

2、3蛋白, 其中1株（1B1）可与SW480细胞成份反映。结论: 成功成立稳固分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株, 其分泌的抗体特异性强、 效价高, 为研究DcR3在组织中的表达、 散布及研制ELISA试剂盒奠定基础。 【关键词】 DcR3 单克隆抗体 制备Abstract AIM: To prepare monoclonal antibodies(mAbs) against human DcR3 and identify their characterization. METHODS: BALB/c mice were immunized with purified His DcR3 pr

3、otein, and mAbs against DcR3 which prepared by hybridoma technique were purified and identified by their specificity, subtype, titers via ELISA and Western blot. RESULTS: Five hybridoma cell lines secreting mAbs against human DcR3 were obtained, which were determined as IgG1 subtype and ascites tite

4、rs of five mAbs against DcR3 reached 110-5-110-7. Five mAbs were proved to recognize His DcR3 protein specifically, one of which (1B1) could recognize SW480 cell. CONCLUSION: mAbs against DcR3 with high titers and specificity have been prepared and purified successfully, which laid a foundation for

5、the study of DcR3 expression, distribution in tissu and development of ELISA kit.KeywordsDcR3; monoclonal antibody; preparation诱骗受体3(decoy receptor 3, DcR3, 又称TR6)为最近几年新发觉的一种可溶性肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员, 可竞争性结合肿瘤坏死因子(TNF)成员LIGHT、 FasL及TL1A1, 2, 但并非介导细胞凋亡, 在细胞的生长、 分化、 死亡和免疫调剂等方面发挥重要作用, 与肿瘤、 自身免疫疾病、 移植排斥等紧密

6、相关。应用DcR3抗体研究DcR3在上述病变组织或细胞中的表达现已成为研究热点。目前, 国外已有商品化的抗人DcR3 mAb, 但价钱昂贵, 国内尚无这方面的研究报导。咱们运用淋巴细胞杂交瘤技术制备了抗人DcR3 mAb, 并进行了鉴定, 为研究DcR3在组织中的表达、 散布及研制ELISA试剂盒奠定基础。1 材料和方式 材料 纯化的His DcR3融合蛋白为本室自制3; RPMI1640购自Hyclone公司; PEG4000购自Merck公司; HAT、 HT购自Sigma公司; HRP标记的羊抗鼠及羊抗兔IgG抗体购自Santa Cruze公司; 抗体亚类测定试剂盒购自Serotech公

7、司; Protein A亲和层析胶购自Pierce公司; PVDF膜购自Amresco公司; ECL化学发光试剂盒购自Amersham公司。Sp2/0细胞株取自东北师范大学细胞遗传所; 高表达DcR3的人结肠癌SW480细胞株由本室保留; BALB/c小鼠(68周龄, 雌性, 清洁级)购自吉林省生物制品所。 方式 动物免疫 纯化的His DcR3融合蛋白免疫BALB/c小鼠, 第一次免疫取100 L (约50 g)抗原加等量弗氏完全佐剂充分乳化, 腹腔注射, 第14天取100 L(约50 g)加等量弗氏不完全佐剂增强免疫, 以后每隔2周等量抗原不加佐剂腹腔免疫2次, 测定小鼠血清抗体效价达11

8、06以上时预备融合, 融合前3 d取效价最高的小鼠腹腔注射抗原100 g。 杂交瘤细胞株的成立及mAb的制备 (1)细胞融合: 无菌条件下, 取对数生长的Sp2/0细胞, 1000 r/min离心8 min, 弃上清, 用RPMI1640不完全培育液混悬细胞后计数, 取所需的细胞数。制备免疫小鼠脾细胞悬液, 将Sp2/0细胞与脾细胞按15的比例混合, 37水浴500 mL/L PEG4000作用下进行融合, 融合后1000 r/min离心8 min, 弃上清, 用含有饲养细胞的HAT选择培育液轻轻混悬, 接种在96孔细胞培育板中, 置37、 50 mL/L CO2培育箱培育。第10天换HT选择

9、培育液, 第14天换含200 mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培育液。(2)挑选及克隆化: 23周后当杂交瘤细胞长至孔底面积1/10以上时, 别离包被His DcR3融合蛋白与His蛋白, 同时设立阴、 阳性及空白对照, 应用间接ELISA方式检测培育上清液。以P/N为阳性, 选取与His DcR3融合蛋白反映阳性而与His蛋白反映阴性孔的细胞通过有限稀释法持续克隆23次, 直至所有单个克隆细胞阳性孔率为100%时扩大培育, 进行细胞冻存和腹水制备。（3）腹水制备及纯化:每只BALB/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡500 L, 7 d后每只鼠腹腔接种杂交瘤细胞6105个, 14 d左右搜集腹

10、水。SiO2吸附法对腹水进行预处置, 采纳辛酸 饱和硫酸铵沉淀法4、ProteinA亲和层析进行纯化, 紫外分光光度法测定纯化后mAb含量, 纯化后mAb过滤除菌加等量甘油, 分装-70冻存。 mAb的鉴定 （1）效价的测定: 将纯化前后的mAb倍比稀释, 以1200稀释的正常小鼠血清作为阴性对照, 应用间接ELISA方式测定A492, 以P/N为阳性。（2）免疫球蛋白类和亚类的鉴定: 按操作说明将杂交瘤上清1200稀释, 取150 L稀释液加入含有亚类定性试剂的试管底部, 30 s后将试纸条插入管底, 510 min后观看结果, 判读轻链、 重链。(3)杂交瘤细胞染色体核型分析: 生长良好的

11、杂交瘤细胞悬液10 mL加入秋水仙素, 使其终浓度为 mg/L, 继续培育3 h, 1000 r/min离心10 min, 重蒸水室温低渗处置20 min, 离心弃上清, 细胞固定后Gimsa染色, 油镜下观看染色体计数。（4）相对亲和力鉴定: 参照文献5。采纳非竞争ELISA方式确信单克隆抗体的亲和力。别离以不同浓度（一、 五、 10 g/L）的纯化的DcR3融合蛋白为固相, 加入倍比稀释的纯化mAb及HRP标记的羊抗小鼠IgG, 以OPD为底物测定A492值。依照公式Kaff=(n1)/2(nAbAb)计算各mAb亲和力大小。（5）Western blot鉴定抗体特异性: 将纯化的DcR3

12、蛋白、 pET 28a(+)空载体蛋白、 人结肠癌SW480细胞株培育上清及细胞裂解制成的细胞悬液经SDS PAGE电泳后转印至PVDF膜上, 以15000稀释的小鼠腹水为一抗, 以110000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗, 通过ECL显色系统进行Western blot检测。2 结果 杂交瘤细胞株的成立 HAT选择培育3日可见融合的细胞克隆, 融合率为%（269/288）, 阳性克隆率为%（246/288）, 经有限稀释法对阳性克隆进行23次克隆, 共取得5株能稳固分泌特异性抗人DcR3的mAb杂交瘤细胞株, 别离命名为1A九、 1B一、 1F五、 1G4及2H6。 腹水mAb的

13、纯化 腹水经proteinA层析柱纯化后, 进行SDS PAGE凝胶电泳扫描, 鉴定其纯度为95%。相对分子质量（Mr）为146000 (轻链为23000, 重链为50000, 图1）。紫外分光光度法测定纯化蛋白的浓度为15 g/L。图1 纯化DcR3 mAb(1B1)的SDS PAGE分析（略）Fig 1 SDS PAGE analysis of antibodies after ProteinA affinity chromatograph (1B1)1: Purified mAb; 2: Pre purified mAb. mAb的特性鉴定 mAb效价、 亚类、 染色体及亲和常数的鉴定,

14、 结果见表1。表1 mAb效价、 亚类、 染色体及亲和常数的鉴定（略）Tab 1 Identification of mAb value, isotype, chromosome and affinity constant Western blot分析 5株杂交瘤细胞株分泌的抗DcR3 mAb均能与转印至PVDF膜上的DcR3融合蛋白在Mr约为33000处形成单一的阳性染色带, 而且与pET载体蛋白无交叉反映, 其中1B1 mAb能够识别高表达DcR3的人结肠癌SW480细胞成份(图2)。图2 mAb Western blot分析（略）Fig 2 Western blot analysis o

15、f the 1B1 mAb1: Purified DcR3 protein; 2: Induced pET28a(+) ; 3: SW480 lysate; 4: SW480 culture supernatant.3 讨论 DcR3 mRNA序列全长1114 bp, 含一个开放读码框, 编码300个氨基酸, N结尾前29个氨基酸为信号肽序列, 蛋白Mr约35000。DcR3肽链含4个串联的富集半胱氨酸的重复序列, 此为TNFR超家族的一起标志, 但与其他大部份TNFR超家族成员不同的是DcR3缺乏跨膜结构, 故属于分泌性蛋白2。DcR3可竞争性地与TNF超家族成员FasL、 LIGHT、 T

16、L1A结合, 抑制配体与死亡受体的结合, 从而阻断配体介导的细胞凋亡, 有助于肿瘤细胞、 活化的自身免疫细胞免受机体免疫系统的清除。研究说明DcR3在许多恶性肿瘤组织和细胞株（如人结肠癌SW480细胞株）和自身免疫病的外周血单个核细胞（PBMC）过度表达1, 6。还有研究发觉, DcR3表达水平与肿瘤分化类型和分期紧密相关7, 8, 因此, 应用DcR3抗体通过免疫组化、 ELISA等方式观看DcR3在病变组织或体液中的表达情形对相关疾病的诊断、 预后及疗效观看具有重要作用。另外, 也能够利用DcR3 mAb中和DcR3蛋白, 解除其对肿瘤的抗凋亡和下调宿主免疫功能的作用, 达到辅助医治肿瘤的

17、的目的。 咱们利用本室自制并已通过纯化和鉴定的His DcR3融合蛋白免疫BALB/c小鼠, 在传统的淋巴细胞杂交瘤技术基础上进行了以下优化: （1）改良免疫方案, 选择融合机会, 直至小鼠产生百万以上高抗体滴度时方进行融合, 现在分泌抗体的脾脏B淋巴细胞多, 大大增加了阳性克隆率; （2）依照融合后细胞生长情形适当增减HAT和HT用量, 以避免毒性过大细胞死亡或剂量不足不能起到挑选作用; （3）对杂交瘤进行ELISA双挑选, 去除DcR3融合蛋白中His蛋白的干扰, 相对提高了免疫抗原的特异性, 保证所挑选到的杂交瘤细胞所分泌的mAb只针对DcR3抗原决定簇而非His决定簇。通过上述优化,

18、取得了高效价、 特异性强的抗人DcR3 mAb, 其中1B1杂交瘤细胞株分泌的mAb可识别高表达DcR3蛋白的人结肠癌SW480细胞株的细胞裂解悬液和培育上清。所成立的杂交瘤细胞株经数次冻存、 苏醒, 体别传代培育3个月以上仍能稳固分泌高效价mAb。总之, 抗人DcR3 mAb的成功研制， 为研究DcR3蛋白功能、 纯化DcR3蛋白、 临床上检测相关疾病血清DcR3含量及在组织细胞的表达散布奠定实验基础。【参考文献】 1 Yu KY, Kwon B, Ni J, et al. A newly identified member of tumor necrosis factor receptor

19、 superfamily (TR6) suppresses LIGHT mediated apoptosisJ. J Biol Chem, 1999, 274(20): .2 Migone TS, Zhang J, Luo X, et al. TL1A is a TNF like ligand for DR3 and TR6/DcR3 and functions as a T cell costimulatorJ. Immunity, 2002, 16(3): 479-492.3 吴春风, 马忠森, 王秀丽, 等. 人DcR3融合蛋白的表达、 纯化及其多克隆抗体的制备J. 细胞与分子免疫学杂志

20、, 2007， 23（12）: 1160-1162.4 赵永芳. 生物化学技术原理及应用M. 北京: 科学出版社, 2002: 429-430.5 白慧玲, 赵粤萍, 刘广超, 等. 抗死亡受体 5单克隆抗体的制备及特性鉴定J. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22（4）: 514-520.6 Otsuki T, Tomokuni A, Sakaguchi H, et al. Over expression of the decoy receptor 3 (DcR3) gene in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) derived fro

21、m silicosis patientsJ. Clin Exp Immunol, 2000, 119(2): 323-327.7 Takahama Y, Yamada Y, Emoto K, et al. The prognostic significance of overexpression of the decoy receptor for Fas ligand (DcR3) in patients with gastric carcinomasJ. Gastric Cancer, 2002, 5(2): 61-68.8 Li H, Zhang L, Lou H, et al. Overexpression of decoy receptor 3 in precancerous lesions and adenocarcinoma of the esophagusJ. Am J Clin Pathol, 2005, 124(2): 282-287.