抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定.docx
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抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定
抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定
吴春风,马忠森,王秀丽,杨俊玲,杨洋,张越,图们乌力吉,乔俊华
【摘要】 目的:
制备抗人DcR3单克隆抗体（mAb）,并鉴定其特异性。
方式:
纯化的HisDcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3mAb并进行纯化,纯化后的抗体经Westernblot和ELISA方式鉴定其特异性、Ig亚型和效价。
结果:
取得5株稳固分泌抗DcR3mAb的杂交瘤细胞,均属IgG1亚型,其腹水抗体效价为1×10-5～1×10-7,Westernblot显示5株细胞分泌的mAb都可识别DcR3蛋白,其中1株（1B1）可与SW480细胞成份反映。
结论:
成功成立稳固分泌抗人DcR3mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体特异性强、效价高,为研究DcR3在组织中的表达、散布及研制ELISA试剂盒奠定基础。
【关键词】DcR3单克隆抗体制备
[Abstract]AIM:
Topreparemonoclonalantibodies（mAbs）againsthumanDcR3andidentifytheircharacterization.METHODS:
BALB/cmicewereimmunizedwithpurifiedHisDcR3protein,andmAbsagainstDcR3whichpreparedbyhybridomatechniquewerepurifiedandidentifiedbytheirspecificity,subtype,titersviaELISAandWesternblot.RESULTS:
FivehybridomacelllinessecretingmAbsagainsthumanDcR3wereobtained,whichweredeterminedasIgG1subtypeandascitestitersoffivemAbsagainstDcR3reached1×10-5-1×10-7.FivemAbswereprovedtorecognizeHisDcR3proteinspecifically,oneofwhich（1B1）couldrecognizeSW480cell.CONCLUSION:
mAbsagainstDcR3withhightitersandspecificityhavebeenpreparedandpurifiedsuccessfully,whichlaidafoundationforthestudyofDcR3expression,distributionintissuanddevelopmentofELISAkit.
[Keywords]DcR3;monoclonalantibody;preparation
诱骗受体3（decoyreceptor3,DcR3,又称TR6）为最近几年新发觉的一种可溶性肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员,可竞争性结合肿瘤坏死因子（TNF）成员LIGHT、FasL及TL1A[1,2],但并非介导细胞凋亡,在细胞的生长、分化、死亡和免疫调剂等方面发挥重要作用,与肿瘤、自身免疫疾病、移植排斥等紧密相关。
应用DcR3抗体研究DcR3在上述病变组织或细胞中的表达现已成为研究热点。
目前,国外已有商品化的抗人DcR3mAb,但价钱昂贵,国内尚无这方面的研究报导。
咱们运用淋巴细胞杂交瘤技术制备了抗人DcR3mAb,并进行了鉴定,为研究DcR3在组织中的表达、散布及研制ELISA试剂盒奠定基础。
1材料和方式
材料纯化的HisDcR3融合蛋白为本室自制[3];RPMI1640购自Hyclone公司;PEG4000购自Merck公司;HAT、HT购自Sigma公司;HRP标记的羊抗鼠及羊抗兔IgG抗体购自SantaCruze公司;抗体亚类测定试剂盒购自Serotech公司;ProteinA亲和层析胶购自Pierce公司;PVDF膜购自Amresco公司;ECL化学发光试剂盒购自Amersham公司。
Sp2/0细胞株取自东北师范大学细胞遗传所;高表达DcR3的人结肠癌SW480细胞株由本室保留;BALB/c小鼠（6～8周龄,雌性,清洁级）购自吉林省生物制品所。
方式
动物免疫纯化的HisDcR3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,第一次免疫取100μL（约50μg）抗原加等量弗氏完全佐剂充分乳化,腹腔注射,第14天取100μL（约50μg）加等量弗氏不完全佐剂增强免疫,以后每隔2周等量抗原不加佐剂腹腔免疫2次,测定小鼠血清抗体效价达1∶106以上时预备融合,融合前3d取效价最高的小鼠腹腔注射抗原100μg。
杂交瘤细胞株的成立及mAb的制备
（1）细胞融合:
无菌条件下,取对数生长的Sp2/0细胞,1000r/min离心8min,弃上清,用RPMI1640不完全培育液混悬细胞后计数,取所需的细胞数。
制备免疫小鼠脾细胞悬液,将Sp2/0细胞与脾细胞按1∶5的比例混合,37℃水浴500mL/LPEG4000作用下进行融合,融合后1000r/min离心8min,弃上清,用含有饲养细胞的HAT选择培育液轻轻混悬,接种在96孔细胞培育板中,置37℃、50mL/LCO2培育箱培育。
第10天换HT选择培育液,第14天换含200mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培育液。
（2）挑选及克隆化:
2～3周后当杂交瘤细胞长至孔底面积1/10以上时,别离包被HisDcR3融合蛋白与His蛋白,同时设立阴、阳性及空白对照,应用间接ELISA方式检测培育上清液。
以P/N≥为阳性,选取与HisDcR3融合蛋白反映阳性而与His蛋白反映阴性孔的细胞通过有限稀释法持续克隆2～3次,直至所有单个克隆细胞阳性孔率为100%时扩大培育,进行细胞冻存和腹水制备。
（3）腹水制备及纯化:
每只BALB/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡500μL,7d后每只鼠腹腔接种杂交瘤细胞6×105个,14d左右搜集腹水。
SiO2吸附法对腹水进行预处置,采纳辛酸饱和硫酸铵沉淀法[4]、ProteinA亲和层析进行纯化,紫外分光光度法测定纯化后mAb含量,纯化后mAb过滤除菌加等量甘油,分装-70℃冻存。
mAb的鉴定
（1）效价的测定:
将纯化前后的mAb倍比稀释,以1∶200稀释的正常小鼠血清作为阴性对照,应用间接ELISA方式测定A492,以P/N≥为阳性。
（2）免疫球蛋白类和亚类的鉴定:
按操作说明将杂交瘤上清1∶200稀释,取150μL稀释液加入含有亚类定性试剂的试管底部,30s后将试纸条插入管底,5～10min后观看结果,判读轻链、重链。
（3）杂交瘤细胞染色体核型分析:
生长良好的杂交瘤细胞悬液10mL加入秋水仙素,使其终浓度为mg/L,继续培育3h,1000r/min离心10min,重蒸水室温低渗处置20min,离心弃上清,细胞固定后Gimsa染色,油镜下观看染色体计数。
（4）相对亲和力鉴定:
参照文献[5]。
采纳非竞争ELISA方式确信单克隆抗体的亲和力。
别离以不同浓度（一、五、10g/L）的纯化的DcR3融合蛋白为固相,加入倍比稀释的纯化mAb及HRP标记的羊抗小鼠IgG,以OPD为底物测定A492值。
依照公式Kaff=（n－1）/2（nAb’－Ab）计算各mAb亲和力大小。
（5）Westernblot鉴定抗体特异性:
将纯化的DcR3蛋白、pET28a（+）空载体蛋白、人结肠癌SW480细胞株培育上清及细胞裂解制成的细胞悬液经SDSPAGE电泳后转印至PVDF膜上,以1∶5000稀释的小鼠腹水为一抗,以1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗,通过ECL显色系统进行Westernblot检测。
2结果
杂交瘤细胞株的成立HAT选择培育3日可见融合的细胞克隆,融合率为%（269/288）,阳性克隆率为%（246/288）,经有限稀释法对阳性克隆进行2～3次克隆,共取得5株能稳固分泌特异性抗人DcR3的mAb杂交瘤细胞株,别离命名为1A九、1B一、1F五、1G4及2H6。
腹水mAb的纯化腹水经proteinA层析柱纯化后,进行SDSPAGE凝胶电泳扫描,鉴定其纯度为95%。
相对分子质量（Mr）为146000（轻链为23000,重链为50000,图1）。
紫外分光光度法测定纯化蛋白的浓度为15g/L。
图1纯化DcR3mAb（1B1）的SDSPAGE分析（略）
Fig1SDSPAGEanalysisofantibodiesafterProteinAaffinitychromatograph（1B1）
1:
PurifiedmAb;2:
PrepurifiedmAb.
mAb的特性鉴定mAb效价、亚类、染色体及亲和常数的鉴定,结果见表1。
表1mAb效价、亚类、染色体及亲和常数的鉴定（略）
Tab1IdentificationofmAbvalue,isotype,chromosomeandaffinityconstant
Westernblot分析5株杂交瘤细胞株分泌的抗DcR3mAb均能与转印至PVDF膜上的DcR3融合蛋白在Mr约为33000处形成单一的阳性染色带,而且与pET载体蛋白无交叉反映,其中1B1mAb能够识别高表达DcR3的人结肠癌SW480细胞成份（图2）。
图2mAbWesternblot分析（略）
Fig2Westernblotanalysisofthe1B1mAb
1:
PurifiedDcR3protein;2:
InducedpET28a（+）;3:
SW480lysate;4:
SW480culturesupernatant.
3讨论
DcR3mRNA序列全长1114bp,含一个开放读码框,编码300个氨基酸,N结尾前29个氨基酸为信号肽序列,蛋白Mr约35000。
DcR3肽链含4个串联的富集半胱氨酸的重复序列,此为TNFR超家族的一起标志,但与其他大部份TNFR超家族成员不同的是DcR3缺乏跨膜结构,故属于分泌性蛋白[2]。
DcR3可竞争性地与TNF超家族成员FasL、LIGHT、TL1A结合,抑制配体与死亡受体的结合,从而阻断配体介导的细胞凋亡,有助于肿瘤细胞、活化的自身免疫细胞免受机体免疫系统的清除。
研究说明DcR3在许多恶性肿瘤组织和细胞株（如人结肠癌SW480细胞株）和自身免疫病的外周血单个核细胞（PBMC）过度表达[1,6]。
还有研究发觉,DcR3表达水平与肿瘤分化类型和分期紧密相关[7,8],因此,应用DcR3抗体通过免疫组化、ELISA等方式观看DcR3在病变组织或体液中的表达情形对相关疾病的诊断、预后及疗效观看具有重要作用。
另外,也能够利用DcR3mAb中和DcR3蛋白,解除其对肿瘤的抗凋亡和下调宿主免疫功能的作用,达到辅助医治肿瘤的的目的。
咱们利用本室自制并已通过纯化和鉴定的HisDcR3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,在传统的淋巴细胞杂交瘤技术基础上进行了以下优化:
（1）改良免疫方案,选择融合机会,直至小鼠产生百万以上高抗体滴度时方进行融合,现在分泌抗体的脾脏B淋巴细胞多,大大增加了阳性克隆率;
（2）依照融合后细胞生长情形适当增减HAT和HT用量,以避免毒性过大细胞死亡或剂量不足不能起到挑选作用;（3）对杂交瘤进行ELISA双挑选,去除DcR3融合蛋白中His蛋白的干扰,相对提高了免疫抗原的特异性,保证所挑选到的杂交瘤细胞所分泌的mAb只针对DcR3抗原决定簇而非His决定簇。
通过上述优化,取得了高效价、特异性强的抗人DcR3mAb,其中1B1杂交瘤细胞株分泌的mAb可识别高表达DcR3蛋白的人结肠癌SW480细胞株的细胞裂解悬液和培育上清。
所成立的杂交瘤细胞株经数次冻存、苏醒,体别传代培育3个月以上仍能稳固分泌高效价mAb。
总之,抗人DcR3mAb的成功研制，为研究DcR3蛋白功能、纯化DcR3蛋白、临床上检测相关疾病血清DcR3含量及在组织细胞的表达散布奠定实验基础。
【参考文献】
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