基因工程知识结构生工DOC.docx

1、基因工程知识结构生工DOC基因工程课程知识结构第一章 基因工程概述一、 基因工程的内容与应用（一）基本概念通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。（二）Technical process of genetic engineering1Cloning of target gene2Preparation of vectors3Joining the target gene to vectors to produce recombinant DNA4Introduction the

2、recombinant DNA into host cells5Identification and selection of the recombinant6Propagation of the recombinant DNA in a host cell（三）Basic conditions1Four elements: Target gene, Vectors, Enzymes, Host cells2Three major components: Donors, Receptors, Vectors3Three tools: Restriction endonuclease-Molec

3、ular scissorsDNA ligase-Molecular glueVectors-Molecular Transporter（四）基因策略（五）研究目的和应用领域1PurposeThere are many areas in which genetic manipulation is of value, including the following:(1) Production of useful protein by novel methods: 1982年，第一个基因工程菌生产药物-重组人胰岛素，在美国和英国获准使用，标志着医药领域进入一个新纪元。(2) Generation

4、of transgenic plants and animals: 1981年，Palmiter和Brinster成功获得第一个转基因小鼠(3) Genome analysis by DNA sequencing: 1999年，中国正式加入“人类基因组计划”（HGP human genome project）。(4) Basic research on gene structure and function: 1990年，美国批准第一个体细胞基因治疗方案。2Application（1）第四次工业大革命a 医学：抗病毒、抗癌因子、新型抗生素、疫苗、抗衰老保健品、心脏血管药物等b 轻工食品：氨基酸

5、、助鲜剂、甜味剂、食品色素、酒类、油类、淀粉酶等c 化学能源：石油二次开采、有机物生产、纤维素分解、生物能、太阳能转换d 环保：分解性能较高的工程菌种和具有特殊降解功能的菌株，如石油降解质粒、农药降解质粒、工业降解质粒 e 信息：蛋白芯片、基因芯片（2）第二次农业大革命a 生物农药：蛋白类杀虫剂、除草剂b 农作物品种改良：高营养、长保存、抗环境压力、抗病虫害、花卉颜色与型状c 畜牧业：高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率d 固氮作用（3）第二次医学大革命a 疫苗：DNA重组乙肝疫苗b 药物：多肽和蛋白质：重组人胰岛素、干扰素、人生长激素、白细胞介素-2等酶类：尿激酶原、链激酶、天冬酰氨酸、超氧化

6、物歧化酶等c基因诊断：-珠蛋白基因探针检测镰状细胞贫血症、-珠蛋白基因探针检测地中海贫血症、苯丙氨酸转移酶基因探针检测苯丙酮酸症d 基因治疗：腺苷脱氨酶缺乏症、肿瘤、心血管病、糖尿病二、 基因工程发展历史和理论基础（一） 理论基础和技术支撑1.理论上的三大发现1） 基因的载体是DNA 2） DNA的双螺旋结构和半保留复制机理3） 遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立2.技术上的三大发现A number of developments provided the necessary stimulus for gene manipulation to become a realit

7、y.1）Enzymes-Cutting and joining DNA2）DNA sequence3）Vectors -DNA replication（二）发展历程1诞生1973年，Cohen等获得了抗四环素和卡那霉素的重组菌落TcrNer，基因工程发展史上第一次实验重组体转化成功，标志着基因工程的诞生。2发展3腾飞Chapter 2 EnzymesNucleases：Nuclease enzymes degrade nucleic acids by breaking the phosphodiester bond (磷酸二酯键) that holds the nucleotides toge

8、therExonuclease: degrade DNA from the termini of the molecule Endonuclease: Cut within a DNA strand1 Restriction Endonuclease1.1 ConceptionThe endonucleases which recognize a specic sequence of bases in the DNA and cut DNA at dened sites. （二）分类（三）II型限制性内切核酸酶的命名命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中

9、发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。如，HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶。EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。（四）Characteristic1. Specificity of the recognition sequence（1）The most common recognition sequences being four, five, or six base pairs in length（2

10、）180rotational symmetry of the palindromic structure2. Specificity of the cutting sites（1）Cutting in double strand DNA Produce three different ends （2）Allozyme：识别相同的序列但切割位点不一样的两种酶。（3）Isoschizomer：识别位点和切割位点均相同的两种酶。（4）Isocaudamer：识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。（五）Factors that affect the enzyme activity （六）A

11、pplication of restriction endonucleases: Double digestion, Complete digestion, Partial digestion二、DNA连接酶（一）概念：能催化双链DNA片段靠在一起的3羟基末端与5磷酸基末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种酶。 （二）种类：T4 DNA Ligase， E.coli DNA Ligase，Thermal stable DNA ligase （二）特点：（三）影响连接反应的因素三、DNA聚合酶（一）功能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH端，催化核

12、苷酸的聚合作用。Synthesis copies of nucleic acid molecules.（二）分类1DNA polymerase I大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质：53DNA聚合酶活性，53核酸外切酶活性和3 5的核酸外切酶活性，利用前两种特性进行缺口前移标记探针。2Klenow fragment: 不具有53核酸外切酶活性，3T4 DNA polymerase4T7 DNA polymerase5Taq DNA polymerase6Reverse transcriptase: RNA dependent DNA polymerase四、DNA modifying enzym

13、es（一）Terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT)：TdT repeatedly adds nucleotides to an available 3 terminus.（二）Alkaline phosphatase: Remove phosphate groups from the 5 ends of DNA, leaving a 5-OH group.（三）Polynucleotide kinase：Adds phosphate group to the 5 ends of DNA.五、核酸酶：降解DNA或RNAChapter 3Vectors定

14、义: 携带外源基因进入宿主细胞进行复制、整合或表达的工具。第一节 克隆载体Conception: Cloning vector is a DNA molecule that allows the exogenous DNA to be inserted, stored, and brings the exogenous DNA into host cells. Essential features of a cloning vector:（1）Transitivity （2）Independent replication （3）MCS（4）Selectable markers一、Plasmid

15、 vector（一）Conception1Plasmid：存在于多种宿主细胞中、独立于染色体外的能自主复制的闭合环状的双链DNA分子。2.多克隆位点：含有多个限制限内切核酸酶的单一识别位点的一段核苷酸序列。（二）Function of plasmid（三）Characteristic of plasmid1Independent replication；2Incompatibility；3Transitivity（四）Construction of plasmid vectors（1）Select the appropriate origin（2）Add selection markers（3

16、）Reduce or add recognition sites for the restriction enzyme（4）Shorten length（5）Transformation of security（5）Basic cloning plasmids二、Bacteriophage vectors（一）IntroductionConception of bacteriophage: Bacteriophage is the virus that can infect bacteria. Composition, types and features of phage.（二） phage

17、 vector1Characteristic of phage：cos site2Construction of phage vector:（1）Shorten length: Based on the removed length, the phage vectors fail into two main classes: insertion vectors and replacement vectors（2）Reduce or add recognition sites for the restriction enzyme（3）Add selection markers: 免疫功能类标记、

18、颜色反应类标记（4）Establish in vitro packaging system3噬菌体作为载体的特点 DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转导大肠杆菌 装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量 重组DNA分子的筛选和提取较为简便 DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因（三）M13单链噬菌体1生物学特性2构建3载体的特点：（1）克隆的DNA片段以单链形式输出受体细胞外；（2）M13重组分子筛选简便；（3）最大缺陷是装载量小，只有1.5kb三、噬菌体-质粒杂合载体（一）目的（二）思路（三）考斯质粒（粘粒，cosmid）1构建：由噬菌体载体的cos序列和质粒的复制

19、子、抗性基因和多克隆位点共同组成2Characteristic of cosmid：具有质粒和噬菌体的双重特征(1) A highly efficient and specific method of introducing the recombinant DNA into the host cell like vector(2) A cloning capacity like plasmid(3) Insert sizes of 3040kb（四）噬菌粒（Phagemid）1定义：一类含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、多克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。2特点：具有质粒和单链噬

20、菌体的双重特征(1)像M13-DNA那样体外包装，并高效转导受体细胞；(2)像质粒那样在受体细胞中自主复制；(3)Insert sizes of 10kb；(4)通过克隆双链DNA能获得单链DNA；(5)重组操作简便，筛选容易四、人工染色体载体（一）目的：增大装载量载体装载量（kb）M131.5质粒8噬菌粒10噬菌体1025考斯质粒3040BAC50300YAC250400（二）定义：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体。（三）结构：穿梭载体：可以在两种生物体内复制的载体分子。（四）酵母人工染色体载体（YAC）（五）细菌人工染色体载体第二节 表达载体一、质粒表达

21、载体（一）原核表达载体1.表达元件：The essential elements of the prokaryotic (原核) expression vector are promoter，terminator, and SD sequence.2.表达方式：组成型表达、诱导型表达、融合型表达、分泌型表达3.典型的原核表达载体（二）酵母表达载体（三）Ti质粒表达载体T-DNA：Ti质粒中能转移到植物细胞中的一段DNA。（四）动物质粒表达载体二、病毒表达载体三、大片段表达载体第三节 特殊用途的载体一、插入或定点突变载体二、启动子探针型表达载体三、RNAi载体第四章基因工程的主要技术及其原理第一

22、节质粒DNA的提取一、SDS碱裂解法制备质粒DNA的基本原理（1）细胞壁和细胞膜：溶菌酶和SDS（Triton X-100）破坏和裂解细胞（2）RNA：不含DNA酶的NRase降解（3）Pr：苯酚和氯仿抽提；碱变性；EDTA是二价金属离子（如Mg2+等)的螯合剂，抑制核酸酶的活性，保护质粒DNA免被降解。（4）染色体DNA：根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异实现分离。在pH12-12.5时，线性染色体DNA被彻底变性，虽然cccDNA的H键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当加入pH4.8的KAc，使溶液恢复中性时，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而

23、相互缠绕，不能复性，经离心即可把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。（5）其它可溶性物质：用70%乙醇或异丙醇沉淀DNA。第二节 Gel electrophoresis一、Conception：用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳。二、Types：聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辩率0.0011kb琼脂糖凝胶电泳：分辩率0.160kb三、Principle1. Separation mechanism of gel electrophoresis：Charge effect and Molecular sieve effect2. Factors that affec

24、t the migration rate：（1）Molecular characterization: Charges, Fragment length, Molecular structure（2）Electrophoresis system:1) Type and concentration of gel2) Ionic strength of buffer: TAE、TBE、TPE3) Strength of electric field3.EB的染色机理四、操作过程五、用途第三节 杂交技术一、概述1核酸分子杂交：是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下按碱基互补的原则退火形成异

25、质双链的过程。 Southern杂交、Northern杂交2蛋白分子杂交：以抗原-抗体及受体-配体特异结合反应为特征的Western杂交。3探针与探针标记探针：带有能检测的标记物的用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA或RNA。探针标记：使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程。二、Southern杂交.基本过程：（1)基因组DNA提取；（2)酶切成DNA片段； （3)琼脂糖凝胶电泳；（4)碱变性成单链；（5)转移；（6)固定；（7)杂交；（8)显影2.基本特点：来源：酶切，琼脂糖凝胶电泳检测对象：DNA探针：DNA或RNA三、orthern杂交.基本原理细胞总RNA或mRNA 经变性、

26、电泳分离，再转移到固相支持物上与探针杂交的实验技术。2.基本程序与Southern杂交基本相同，不同点在于：为单链，不需碱处理，但要除去其二级结构，常用变性电泳，如甲醛变性电泳、羧甲基汞变性电泳和乙二醛变性电泳。3.基本特点来源：琼脂糖凝胶电泳检测对象：RNA探针：DNA四、原位杂交1.基本原理：直接以菌落、菌斑或组织切片为对象来检测特定核酸序列的方法。2.菌落原位杂交基本程序菌落培养-影印-碱裂解DNA-杂交-显影或标记酶显色3.基本特点来源：菌落、噬菌斑或组织切片检测对象：DNA、RNA探针：DNA、RNA五、Western杂交1.基本原理通过将SDS-PAGE分离后的蛋白质组分转移至固定

27、化基质上，再以免疫学方法用特异性抗体分析靶蛋白的存在及其含量，是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测方法。2.基本步骤：蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳转印杂交标记酶显色3.基本特点来源：SDS-PAGE检测对象：Pr探针：PrComparison of three hybridization MethodsMethodsDetection TargetProbeSouthern blotDNADNA、RNANorthern blotRNADNAWestern blotPrPr第四节 生物芯片一、定义：将细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分，通过微加工技术和微电子技术集中点在一个

28、小的固体芯片表面以实现对它们的准确、快速、大信息量的检测分析。二、分类：基因芯片、蛋白芯片三、特点：高通量、微型化、自动化第五节PCR技术-聚合酶链式反应一、PCR技术的原理1. 原理：在有DNA单链、与DNA单链互补的寡核苷酸引物、dNTPs及DNA聚合酶的情况下，当引物与单链的互补区结合后，在DNA聚合酶的催化作用下即可进行DNA单链的53合成反应。 其基本原理是根据细胞分裂中DNA的半保留复制机理。2. Precedure（1）Pre-denaturation：破坏DNA的超螺旋结构和变性蛋白质（2）Denaturation：打开双链DNA的氢键，使双链DNA变成单链DNA（3）Anne

29、aling：单链DNA与引物结合（4）Extension：DNA链的合成第（2）（4）步循环30次（5）Extension：保证DNA分子的完整性（6）Preservation二、Essential features of PCR1. Buffer; 2. Template; 3. dNTP; 4. DNA polymerase; 5. Primer三、PCR技术的应用（一）RTPCR: 在mRNA反转录之后进行的PCR扩增。（二）锚定PCR（A-PCR）（三）反向PCR（四）不对称PCR（五）实时定量PCR（六）随机扩增的多态性DNA技术（RAPD）（七）其它PCR第六节DNA序列分析一、M

30、axamGilbert化学降解法1原理：利用特殊的化学试剂处理具末端放射标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组不同长度的DNA片段，然后用电泳分离分析断裂片段的大小，放射自显影，读胶确定DNA序列。 2步骤（1）放射性标记待测序DNA链的末端；（2）化学处理产生DNA短片段；（3）变性PAGE凝胶电泳分离DNA片段；（4）放射自显影；（5）读出核苷酸序列3特点（1）标记待测序DNA链；（2）短片段经化学切割获得；（3）读片时读得就是被测序链。二、Sanger双脱氧链终止法1原理：利用DNA聚合酶合成DNA，在DNA的聚合过程中在特异性的核苷酸位置终止反应而进行的测序。2步骤（1）放射性标记的引物制备；（2）DNA短片段的合成；（3）变性PAGE凝胶电泳；（4）放射自显影；（5）读出核苷酸序列3特点（1）DNA片段通过体外合成；（2）标记的是引物；（3）读片时读得是互补碱基。三、DNA的自动测序1原理：Sanger双脱氧链终止法2关键：采用荧光素标记代替了放射性同位素标记，实现读片的自动化。第七节 基因组文库和cDNA文库一、基因组文库1定义：将某