基因工程知识结构生工DOC.docx
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基因工程知识结构生工DOC
《基因工程》课程知识结构
第一章基因工程概述
一、基因工程的内容与应用
（一）基本概念
通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。
（二）Technicalprocessofgeneticengineering
1．Cloningoftargetgene
2．Preparationofvectors
3．JoiningthetargetgenetovectorstoproducerecombinantDNA
4．IntroductiontherecombinantDNAintohostcells
5．Identificationandselectionoftherecombinant
6．PropagationoftherecombinantDNAinahostcell
（三）Basicconditions
1．Fourelements:
Targetgene,Vectors,Enzymes,Hostcells
2．Threemajorcomponents:
Donors,Receptors,Vectors
3．Threetools:
Restrictionendonuclease----Molecularscissors
DNAligase------Molecularglue
Vectors-----MolecularTransporter
（四）基因策略
（五）研究目的和应用领域
1．Purpose
Therearemanyareasinwhichgeneticmanipulationisofvalue,includingthefollowing:
（1）Productionofusefulproteinbynovelmethods:
1982年，第一个基因工程菌生产药物----重组人胰岛素，在美国和英国获准使用，标志着医药领域进入一个新纪元。
（2）Generationoftransgenicplantsandanimals:
1981年，Palmiter和Brinster成功获得第一个转基因小鼠
（3）GenomeanalysisbyDNAsequencing:
1999年，中国正式加入“人类基因组计划”（HGPhumangenomeproject）。
（4）Basicresearchongenestructureandfunction:
1990年，美国批准第一个体细胞基因治疗方案。
2．Application
（1）第四次工业大革命
a医学：
抗病毒、抗癌因子、新型抗生素、疫苗、抗衰老保健品、心脏血管药物等
b轻工食品：
氨基酸、助鲜剂、甜味剂、食品色素、酒类、油类、淀粉酶等
c化学能源：
石油二次开采、有机物生产、纤维素分解、生物能、太阳能转换
d环保：
分解性能较高的工程菌种和具有特殊降解功能的菌株，如石油降解质粒、农药降解质粒、工业降解质粒
e信息：
蛋白芯片、基因芯片
（2）第二次农业大革命
a生物农药：
蛋白类杀虫剂、除草剂
b农作物品种改良：
高营养、长保存、抗环境压力、抗病虫害、花卉颜色与型状
c畜牧业：
高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率
d固氮作用
（3）第二次医学大革命
a疫苗：
DNA重组乙肝疫苗
b药物：
多肽和蛋白质：
重组人胰岛素、干扰素、人生长激素、白细胞介素-2等
酶类：
尿激酶原、链激酶、天冬酰氨酸、超氧化物歧化酶等
c基因诊断：
-珠蛋白基因探针检测镰状细胞贫血症、-珠蛋白基因探针检测地中海贫血症、苯丙氨酸转移酶基因探针检测苯丙酮酸症
d基因治疗：
腺苷脱氨酶缺乏症、肿瘤、心血管病、糖尿病
二、基因工程发展历史和理论基础
（一）理论基础和技术支撑
1.理论上的三大发现
1）基因的载体是DNA
2）DNA的双螺旋结构和半保留复制机理
3）遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立
2.技术上的三大发现
Anumberofdevelopmentsprovidedthenecessarystimulusforgenemanipulationtobecomeareality.
1）Enzymes----CuttingandjoiningDNA
2）DNAsequence
3）Vectors----DNAreplication
（二）发展历程
1．诞生
1973年，Cohen等获得了抗四环素和卡那霉素的重组菌落TcrNer，基因工程发展史上第一次实验重组体转化成功，标志着基因工程的诞生。
2．发展
3．腾飞
Chapter2Enzymes
Nucleases：
Nucleaseenzymesdegradenucleicacidsbybreakingthephosphodiesterbond（磷酸二酯键）thatholdsthenucleotidestogether
Exonuclease:
degradeDNAfromtheterminiofthemolecule
Endonuclease:
CutwithinaDNAstrand
1RestrictionEndonuclease
1.1Conception
TheendonucleaseswhichrecognizeaspecificsequenceofbasesintheDNAandcutDNAatdefinedsites.
（二）分类
（三）II型限制性内切核酸酶的命名
命名原则：
取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。
该种中发现的不同的酶按照顺序编号I,II,III等。
如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。
若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。
如，HindIII从HaemophilusInfluenzued株中分离的第三个酶。
EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗药性R质粒上。
（四）Characteristic
1.Specificityoftherecognitionsequence
（1）Themostcommonrecognitionsequencesbeingfour,five,orsixbasepairsinlength
（2）180°rotationalsymmetryofthepalindromicstructure
2.Specificityofthecuttingsites
（1）CuttingindoublestrandDNAProducethreedifferentends
（2）Allozyme：
识别相同的序列但切割位点不一样的两种酶。
（3）Isoschizomer：
识别位点和切割位点均相同的两种酶。
（4）Isocaudamer：
识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。
（五）Factorsthataffecttheenzymeactivity
（六）Applicationofrestrictionendonucleases:
Doubledigestion,Completedigestion,Partialdigestion
二、DNA连接酶
（一）概念：
能催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’磷酸基末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种酶。
（二）种类：
T4DNALigase，E.coliDNALigase，ThermalstableDNAligase
（二）特点：
（三）影响连接反应的因素
三、DNA聚合酶
（一）功能
在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH端，催化核苷酸的聚合作用。
Synthesiscopiesofnucleicacidmolecules.
（二）分类
1．DNApolymeraseI
大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质：
5’3’DNA聚合酶活性，5’3’核酸外切酶活性和3’5’的核酸外切酶活性，利用前两种特性进行缺口前移标记探针。
2．Klenowfragment:
不具有5’－3’核酸外切酶活性，
3．T4DNApolymerase
4．T7DNApolymerase
5．TaqDNApolymerase
6．Reversetranscriptase:
RNAdependentDNApolymerase
四、DNAmodifyingenzymes
（一）Terminaldeoxynucleotidyltransferase（TdT）：
TdTrepeatedlyaddsnucleotidestoanavailable3’terminus.
（二）Alkalinephosphatase:
Removephosphategroupsfromthe5’endsofDNA,leavinga5’-OHgroup.
（三）Polynucleotidekinase：
Addsphosphategrouptothe5’endsofDNA.
五、核酸酶：
降解DNA或RNA
Chapter3 Vectors
定义:
携带外源基因进入宿主细胞进行复制、整合或表达的工具。
第一节克隆载体
Conception:
CloningvectorisaDNAmoleculethatallowstheexogenousDNAtobeinserted,stored,andbringstheexogenousDNAintohostcells.
Essentialfeaturesofacloningvector:
（1）Transitivity
（2）Independentreplication
（3）MCS
（4）Selectablemarkers
一、Plasmidvector
（一）Conception
1．Plasmid：
存在于多种宿主细胞中、独立于染色体外的能自主复制的闭合环状的双链DNA分子。
2.多克隆位点：
含有多个限制限内切核酸酶的单一识别位点的一段核苷酸序列。
（二）Functionofplasmid
（三）Characteristicofplasmid
1．Independentreplication；2．Incompatibility；3．Transitivity
（四）Constructionofplasmidvectors
（1）Selecttheappropriateorigin
（2）Addselectionmarkers
（3）Reduceoraddrecognitionsitesfortherestrictionenzyme
（4）Shortenlength
（5）Transformationofsecurity
（5）Basiccloningplasmids
二、Bacteriophagevectors
（一）Introduction
Conceptionofbacteriophage:
Bacteriophageisthevirusthatcaninfectbacteria.
Composition,typesandfeaturesofphage.
（二）phagevector
1．Characteristicofphage：
cossite
2．Constructionofλphagevector:
（1）Shortenlength:
Basedontheremovedlength,theλphagevectorsfailintotwomainclasses:
insertionvectorsandreplacementvectors
（2）Reduceoraddrecognitionsitesfortherestrictionenzyme
（3）Addselectionmarkers:
免疫功能类标记、颜色反应类标记
（4）Establishinvitropackagingsystem
3．λ噬菌体作为载体的特点
◆－DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转导大肠杆菌
◆装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量
◆重组－DNA分子的筛选和提取较为简便
◆－DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因
（三）M13单链噬菌体
1．生物学特性
2．构建
3．载体的特点：
（1）克隆的DNA片段以单链形式输出受体细胞外；
（2）M13重组分子筛选简便；（3）最大缺陷是装载量小，只有1.5kb
三、噬菌体-质粒杂合载体
（一）目的
（二）思路
（三）考斯质粒（粘粒，cosmid）
1．构建：
由λ噬菌体载体的cos序列和质粒的复制子、抗性基因和多克隆位点共同组成
2．Characteristicofcosmid：
具有质粒和噬菌体的双重特征
（1）AhighlyefficientandspecificmethodofintroducingtherecombinantDNAintothehostcelllikeλvector
（2）Acloningcapacitylikeplasmid
（3）Insertsizesof30~40kb
（四）噬菌粒（Phagemid）
1．定义：
一类含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、多克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。
2．特点：
具有质粒和单链噬菌体的双重特征
（1）像M13-DNA那样体外包装，并高效转导受体细胞；
（2）像质粒那样在受体细胞中自主复制；（3）Insertsizesof10kb；（4）通过克隆双链DNA能获得单链DNA；（5）重组操作简便，筛选容易
四、人工染色体载体
（一）目的：
增大装载量
载体
装载量（kb）
M13
1.5
质粒
8
噬菌粒
10
λ噬菌体
10~25
考斯质粒
30~40
BAC
50~300
YAC
250~400
（二）定义：
利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体。
（三）结构：
穿梭载体：
可以在两种生物体内复制的载体分子。
（四）酵母人工染色体载体（YAC）
（五）细菌人工染色体载体
第二节表达载体
一、质粒表达载体
（一）原核表达载体
1.表达元件：
Theessentialelementsoftheprokaryotic（原核）expressionvectorarepromoter，terminator,andSDsequence.
2.表达方式：
组成型表达、诱导型表达、融合型表达、分泌型表达
3.典型的原核表达载体
（二）酵母表达载体
（三）Ti质粒表达载体
T-DNA：
Ti质粒中能转移到植物细胞中的一段DNA。
（四）动物质粒表达载体
二、病毒表达载体
三、大片段表达载体
第三节特殊用途的载体
一、插入或定点突变载体
二、启动子探针型表达载体
三、RNAi载体
第四章 基因工程的主要技术及其原理
第一节质粒DNA的提取
一、SDS碱裂解法制备质粒DNA的基本原理
（1）细胞壁和细胞膜：
溶菌酶和SDS（TritonX-100）破坏和裂解细胞
（2）RNA：
不含DNA酶的NRase降解
（3）Pr：
苯酚和氯仿抽提；碱变性；EDTA是二价金属离子（如Mg2+等）的螯合剂，抑制核酸酶的活性，保护质粒DNA免被降解。
（4）染色体DNA：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异实现分离。
在pH12-12.5时，线性染色体DNA被彻底变性，虽然cccDNA的H键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。
当加入pH4.8的KAc，使溶液恢复中性时，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互缠绕，不能复性，经离心即可把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。
（5）其它可溶性物质：
用70%乙醇或异丙醇沉淀DNA。
第二节Gelelectrophoresis
一、Conception：
用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳。
二、Types：
聚丙烯酰胺凝胶电泳：
分辩率0.001~1kb
琼脂糖凝胶电泳：
分辩率0.1~60kb
三、Principle
1.Separationmechanismofgelelectrophoresis：
ChargeeffectandMolecularsieveeffect
2.Factorsthataffectthemigrationrate：
（1）Molecularcharacterization:
Charges,Fragmentlength,Molecularstructure
（2）Electrophoresissystem:
1）Typeandconcentrationofgel
2）Ionicstrengthofbuffer:
TAE、TBE、TPE
3）Strengthofelectricfield
3.EB的染色机理
四、操作过程
五、用途
第三节杂交技术
一、概述
1．核酸分子杂交：
是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下按碱基互补的原则退火形成异质双链的过程。
Southern杂交、Northern杂交
2．蛋白分子杂交：
以抗原-抗体及受体-配体特异结合反应为特征的Western杂交。
3．探针与探针标记
探针：
带有能检测的标记物的用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA或RNA。
探针标记：
使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程。
二、Southern杂交
１.基本过程：
（1）基因组DNA提取；
（2）酶切成DNA片段；（3）琼脂糖凝胶电泳；（4）碱变性成单链ＤＮＡ；（5）转移；（6）固定；（7）杂交；（8）显影
2.基本特点：
来源：
酶切，琼脂糖凝胶电泳
检测对象：
DNA
探针：
DNA或RNA
三、Ｎorthern杂交
１.基本原理
细胞总RNA或mRNA经变性、电泳分离，再转移到固相支持物上与探针杂交的实验技术。
2.基本程序
与Southern杂交基本相同，不同点在于：
ＲＮＡ为单链，不需碱处理，但要除去其二级结构，常用变性电泳，如甲醛变性电泳、羧甲基汞变性电泳和乙二醛变性电泳。
3.基本特点
来源：
琼脂糖凝胶电泳
检测对象：
RNA
探针：
DNA
四、原位杂交
1.基本原理：
直接以菌落、菌斑或组织切片为对象来检测特定核酸序列的方法。
2.菌落原位杂交基本程序
菌落培养---影印---碱裂解DNA---杂交---显影或标记酶显色
3.基本特点
来源：
菌落、噬菌斑或组织切片
检测对象：
DNA、RNA
探针：
DNA、RNA
五、Western杂交
1.基本原理
通过将SDS-PAGE分离后的蛋白质组分转移至固定化基质上，再以免疫学方法用特异性抗体分析靶蛋白的存在及其含量，是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测方法。
2.基本步骤：
蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳――转印――杂交――标记酶显色
3.基本特点
来源：
SDS-PAGE
检测对象：
Pr
探针：
Pr
ComparisonofthreehybridizationMethods
Methods
DetectionTarget
Probe
Southernblot
DNA
DNA、RNA
Northernblot
RNA
DNA
Westernblot
Pr
Pr
第四节生物芯片
一、定义：
将细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分，通过微加工技术和微电子技术集中点在一个小的固体芯片表面以实现对它们的准确、快速、大信息量的检测分析。
二、分类：
基因芯片、蛋白芯片
三、特点：
高通量、微型化、自动化
第五节PCR技术---聚合酶链式反应
一、PCR技术的原理
1.原理：
在有DNA单链、与DNA单链互补的寡核苷酸引物、dNTPs及DNA聚合酶的情况下，当引物与单链的互补区结合后，在DNA聚合酶的催化作用下即可进行DNA单链的5’→3’合成反应。
其基本原理是根据细胞分裂中DNA的半保留复制机理。
2.Precedure
（1）Pre-denaturation：
破坏DNA的超螺旋结构和变性蛋白质
（2）Denaturation：
打开双链DNA的氢键，使双链DNA变成单链DNA
（3）Annealing：
单链DNA与引物结合
（4）Extension：
DNA链的合成
第
（2）~（4）步循环30次
（5）Extension：
保证DNA分子的完整性
（6）Preservation
二、EssentialfeaturesofPCR
1.Buffer;2.Template;3.dNTP;4.DNApolymerase;5.Primer
三、PCR技术的应用
（一）RT－PCR:
在mRNA反转录之后进行的PCR扩增。
（二）锚定PCR（A-PCR）
（三）反向PCR
（四）不对称PCR
（五）实时定量PCR
（六）随机扩增的多态性DNA技术（RAPD）
（七）其它PCR
第六节 DNA序列分析
一、Maxam—Gilbert化学降解法
1．原理：
利用特殊的化学试剂处理具末端放射标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组不同长度的DNA片段，然后用电泳分离分析断裂片段的大小，放射自显影，读胶确定DNA序列。
2．步骤
（1）放射性标记待测序DNA链的末端；
（2）化学处理产生DNA短片段；（3）变性PAGE凝胶电泳分离DNA片段；（4）放射自显影；（5）读出核苷酸序列
3．特点
（1）标记待测序DNA链；
（2）短片段经化学切割获得；（3）读片时读得就是被测序链。
二、Sanger双脱氧链终止法
1．原理：
利用DNA聚合酶合成DNA，在DNA的聚合过程中在特异性的核苷酸位置终止反应而进行的测序。
2．步骤
（1）放射性标记的引物制备；
（2）DNA短片段的合成；（3）变性PAGE凝胶电泳；（4）放射自显影；（5）读出核苷酸序列
3．特点
（1）DNA片段通过体外合成；
（2）标记的是引物；（3）读片时读得是互补碱基。
三、DNA的自动测序
1．原理：
Sanger双脱氧链终止法
2．关键：
采用荧光素标记代替了放射性同位素标记，实现读片的自动化。
第七节基因组文库和cDNA文库
一、基因组文库
1．定义：
将某
升级会员 