基因克隆步骤.docx

1、基因克隆步骤实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验原理（供参考，试剂盒的Solution SS成份未知） 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的进程。其原理是：在0下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42短时刻热处置（热休克），能够增进细胞吸收DNA复合物。将处置后的细菌放置在非选择性培育液中保温一段时刻，促使在转化进程中取得的新的表型(如Amp抗性) 取得表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37培育留宿，如此即可取得转

2、化菌落。 仪器、材料与试剂 (一)仪器1小型高速离心机2恒温摇床3恒温箱420冰箱5恒温水浴器 (二)材料1氨苄青霉素2大肠杆菌DH5a3pUC1941.5mL 离心管5枪头、枪6试管、培育皿 (三)试剂1快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2LB培育液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨 (tryptone) 10g酵母提取物 (yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调剂pH至7.0，加入去离子水至整体积为1L，121湿热灭菌20min。 3氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mgmL 溶液，置20冰箱保留。 实验步骤 1从大

3、肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培育液的试管中，37振荡培育留宿。 2取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培育液锥形瓶中，37振荡培育2小时。 以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培育物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上警惕地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，避免细胞进入枪内。 4将上述细胞分装于1.5mL离心管 (离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞能够当即利用或贮存。 5将感受态细胞迅速转移到20或更低的低温冰

4、中。注意：在转移进程中要避免温度升高，解决的方法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化：1新鲜制备的或20下保留的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3冰上放置30分钟。 442水浴热激60秒。 5冰上放置2分钟。 6加400mL LB培育液，37 250转分振荡培育30分钟。 7室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培育液将细胞悬浮。 8将细菌涂布在 Amp/LB琼脂平板上。 9平皿在37下正向放置1小时，待接种的

5、液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培育留宿。 实验结果经37培育留宿的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上显现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg 质粒DNA 转化的菌落数表示。实验二 质粒DNA的提取 实验原理 12.5那个狭小的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在如此的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键尽管断裂，但两条互补链彼此仍然彼此盘绕而紧密地结合在一路。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成

6、网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳固的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一路沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。 仪器、材料与试剂 (一)仪器1恒温培育箱2恒温摇床3小型高速离心机4高压灭菌锅 (二)材料1带有pQE31质粒和pUC18CAT质粒的两株大肠杆菌21.5mL 离心管3枪头、枪 (三)试剂质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司) 试剂盒的参考配方:Solution I 50mmo1L 葡萄糖，5mmo1L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)TrisHCl(pH8.0)，1.0 mmo1L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8

7、.0)，Solution II 0.4mo1L Na0H，2SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合Solution II I5mo1L 醋酸钾，60 mL冰乙酸 11.5mL水，28.5mL TE缓冲液，10mmo1L TrisHCl1mmo1L EDTA(pH8.0)，胰RNA酶(RNA酶A)，将RNA酶溶于10mmo1L TrisHCl(pH7.5)、15mmo1L NaCl中，配成10 mgmL的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，保留于20。 实验步骤 (一)提取质粒将3mL含Apm的LB液体培育基加入到两支试管中，别离接入含pQE31质粒和pUC18CAT的大肠杆菌，37

8、振荡培育留宿。以下的操作按试剂盒的说明书进行。(附试剂盒说明书)(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳 将5mL洗脱液与3mL的DNA样品缓冲液混合，加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。 附：试剂盒说明书 3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 31上海申能博彩生物科技bbstshl63net wwwbiocolors 试剂盒组成： 组成 K1910（50次） K1920（100次） K1930（250次） Solution I(a) 5m1 10m1 25m1 Solution II(b) 10m1 20m1 50ml Solution lll 20m1 50m1 2x5

9、0m1 Wash Solution (c) 22m1 2x22m1 5x22m1 TE(d) 5m1 10m1 40m1 3S Column 50支 100支 250支 Co11ection tube 50支 100支 250根 说明书 1份 1份 l份 注： a)Solution I内含RNaseA，每次实验终止后，4保留。 b)温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后利用。 c)第一次利用前，必需在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混勾后利用。每次利用后将瓶盖旋紧，以维持Wash Solution中的乙醇含量。 d)TE pH80或水

10、均能够用十洗脱，可是用水洗脱DNA，效率通常要低些。抽提测序用质粒需要用水洗脱。 要紧特点： 采纳改良的碱裂解方式，质量稳固，重复性好。 经济快速，每一个抽提能够在20分钟内完成。 无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需CsCl离心。 质粒纯度高，洗脱体积小，适合于DNA全白动荧光测序。 实验操作步骤(从细菌中抽提质粒) 1将留宿培育的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，完全去除上清。 2加入100ml solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。注意：关于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；质粒若是用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，II和II

11、I的用量。 3加入200ml Solution II，当即上下倒置或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。 4加入400ml Solution III，当即上卜倒置510次，使之充分中和，室温放置2分钟。注意：步骤2和3在冰上操作成效更佳。 5高速离心，15，000转分钟，10分钟。无需低温离心。注意：提高离心速度，使沉淀加倍紧密，步骤6操作取上清更为方便。 6掏出2m1样品搜集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全数转移到(吸或倒入)3S柱里。盖上离心管盖子(盖子也能够不盖，可是若是您同时有很多样品，担忧混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温放置2分钟 (

12、室温放置时刻不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12，000转分钟)离心1分钟。注意：转移上清时不要吸取沉淀，不然会显现Genomic DNA和蛋白质污染。离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部份溶液从柱子底部流出，为正常现象。 7取下3S柱，弃去掉搜集管中的废液，将3S柱放入同一支搜集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，离心1分钟。 8重复步骤7一次。 9取下3S柱，弃去掉搜集管中的废液，将3S柱放入同支搜集管中，高速离心2分钟。 10将3S柱放入干净的15m1的离心管中，在3S柱子膜中央加 50ml TE或水，不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟；盖上离心

13、管盖，室温高速离心1分钟。注意：将TE或水预热到50左右能够提高洗脱效率。测序用质粒用30ml预热的水洗脱，浓度一样知足测序要求。 11洗脱的质粒能够当即用于各类分子生物学操作或20保留备用。lml留宿培育细胞，质粒若是用50ml水洗脱，通常情形下能够取10ml洗实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验原理 DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以一样的速度向正极方向移动。在必然的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，

14、 迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也能够分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。一样提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA， 即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往显现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，第二为

15、线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。 仪器、材料与试剂(一)仪器1恒温培育箱2琼脂糖凝胶电泳系统3小型高速离心机4高压灭菌锅5紫外核酸检测仪(二)材料1pQE31和pUC18CAT质粒(三)试剂150xTAE(50倍体积的TAE贮存液)配1000mL 50xTAE：Tris 242 g冰醋酸 57 mL0.5molL EDTA 200 mLpH 8.02凝胶加样缓冲液(6x)溴酚蓝 0.25蔗糖 403琼脂糖 4溴化乙锭溶液(EB) 0.5µgmL 5250bp DNA 分子量标准 实验步骤(一)制备琼脂糖凝胶依照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖

16、凝胶浓度 线性DNA的有效分离范围kb0.3 5600.6 13 实验用1.2琼脂糖。称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，掏出摇匀即可。 (二)胶板的制备 1取干净的有机玻璃内槽，用透亮胶带将有机玻璃内槽的两头边缘封好(必然封严，不能留裂缝)。 2将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 3将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。 4待胶凝固后，警惕地拔出梳子，撕下透亮胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。 5加电泳缓冲液

17、至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面11.5毫米。(三)加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。(四)电泳 1接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一样电场强度不要超过5Vcm。 2当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。(五)染色 将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的溴化乙锭贮存液即可)，在脱色摇床上缓慢摇动下染色2030分钟。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并警惕污染环境。 实验结果在紫外灯(360nm或254nm)下观看染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显

18、出桔红色荧光条带(在紫外灯下观看时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的损害作用)。 脱液做Agarose电泳或酶切分析。实验四 DNA重组 实验原理DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，如此从头组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方式要紧有粘端连接法和平端连接法。 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将别离经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。经常使用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性结尾的DNA分子连在一路，而且能使平结尾的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性结尾的连接效率低，一样可通过提高T4噬菌体DN

19、A连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平结尾的连接效率。若是是单酶切，为了避免载体本身的自身连接，能够用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处置，去掉酶切后5端的磷酸。如此做能有效避免质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。连接反映的温度在37时有利于连接酶的活性，可是在如此的温度下，粘性结尾的氢键结合是不稳固的。一样的连接条件是在1216，反映1216小时(留宿)，如此既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性结尾短暂配对结构的稳固。连接产物转化宿主细胞后，还须对转化菌落进行挑选鉴定，挑选出所需的重组质粒。 仪器、材料与试剂(一)仪器1恒温摇床2恒温水浴3恒温培育箱4小型高速离心机(二

20、)材料1 氨苄青霉素2 BamHI3 HindIII4 T4 DNA连接酶5 pQE31 和pUC18CAT 质粒6 培育皿7 接种针8 金属涂棒9 1.5mL 离心管10酒精灯11镊子、灭菌牙签等(三)试剂DNA琼脂糖胶纯化试剂盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit，申能博彩公司） 实验步骤 (一)质粒DNA用实验二提取的pQE31和pUC18CAT 质粒。(二)制备重组DNA1在灭菌的1.5mL 离心管中，加入pQE31质粒10mL(2mgmL)，2mL酶切缓冲液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7

21、mL，至反映混合物整体积为20mL，离心混匀，37反映留宿。2在另一无菌1.5mL 离心管中，加pUC18CAT 质粒20mL，加入3mL酶切反映液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，无菌双蒸水补到30mL，37反映留宿。3反映完毕后取5mL pQE31质粒的酶切液做电泳分析，查验酶切是不是完全。酶切完全，进行下一步。4将酶切处置的后pQE31和pUC18CAT 质粒，别离上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加DNA分子量标准）。电泳终止后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒依照试剂盒说明书的方式回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb，后者为650bp。5将回收的pQE31载体质粒均分为两份，其中

22、一份与酶切后回收的CAT片段混合，做连接；另一份不加CAT片段，做对照。操作如下：在10mL DNA样品中, 加T4 DNA连接酶缓冲液1mL，T4 DNA连接酶1mL，14（室温）留宿，然后做大肠杆菌的转化。(三)转化感受态细胞1用实验一制备的感受态细胞(20保留的)。2在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10mL连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参如实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE31载体质粒连接处置后的感受态细胞转化的对照。 实验结果留宿培育后，实验组和对照组的两个培育皿上都可能会显现一些菌落。若是实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，那么是好征兆，但实验组中显现的菌落是不是含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。