基因克隆步骤.docx

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基因克隆步骤

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

[实验原理]（供参考，试剂盒的SolutionSS成份未知）

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的进程。

其原理是：

在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。

转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。

42℃短时刻热处置（热休克），能够增进细胞吸收DNA复合物。

将处置后的细菌放置在非选择性培育液中保温一段时刻，促使在转化进程中取得的新的表型（如Amp抗性）取得表达。

然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培育留宿，如此即可取得转化菌落。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器

（二）材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL离心管5．枪头、枪6．试管、培育皿

（三）试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB培育液在950mL去离子水中加入：

胰蛋白胨（tryptone）10g酵母提取物（yeastextract）5gNaCl10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调剂pH至7.0，加入去离子水至整体积为1L，121℃湿热灭菌20min。

3．氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成100mg／mL溶液，置‐20℃冰箱保留。

[实验步骤]

1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mLLB培育液的试管中，37℃振荡培育留宿。

2．取50mL菌液转接到一个含有5mLLB培育液锥形瓶中，37℃振荡培育2小时。

以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。

3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培育物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的SolutionSS。

在冰上警惕地用1mL枪头将细胞悬浮起来。

注意：

1mL的取液器设定在500mL。

悬浮细胞要轻，避免细胞进入枪内。

4．将上述细胞分装于1.5mL离心管（离心管要在放在冰上预冷）中，每管0.1mL。

细胞能够当即利用或贮存。

5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。

注意：

在转移进程中要避免温度升高，解决的方法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。

转化：

1．新鲜制备的或‐20℃下保留的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。

2．加入5mLpUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。

3．冰上放置30分钟。

4．42℃水浴热激60秒。

5．冰上放置2分钟。

6．加400mLLB培育液，37℃250转／分振荡培育30分钟。

7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培育液将细胞悬浮。

8．将细菌涂布在Amp/LB琼脂平板上。

9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培育留宿。

[实验结果]经37℃培育留宿的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上显现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。

计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg质粒DNA转化的菌落数表示。

实验二质粒DNA的提取

[实验原理]

‐12.5那个狭小的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在如此的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键尽管断裂，但两条互补链彼此仍然彼此盘绕而紧密地结合在一路。

当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。

通过离心，染色体DNA与不稳固的大分子RNA、蛋白质‐SDS复合物等一路沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器1．恒温培育箱2．恒温摇床3．小型高速离心机4．高压灭菌锅

（二）材料1．带有pQE‐31质粒和pUC18‐CAT质粒的两株大肠杆菌2．1.5mL离心管3．枪头、枪

（三）试剂质粒小量制备试剂盒（3SSpinplasmidMIniprepKitV3.1,申能博彩公司）

试剂盒的参考配方:

SolutionI50mmo1／L葡萄糖，5mmo1／L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl（pH8.0），1.0mmo1／L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0），SolutionII0.4mo1／LNa0H，2％SDS（十二烷基硫酸钠），用前等体积混合SolutionIII5mo1／L醋酸钾，60mL冰乙酸11.5mL水，28.5mLTE缓冲液，10mmo1／LTris·HCl1mmo1／LEDTA（pH8.0），胰RNA酶（RNA酶A），将RNA酶溶于10mmo1／LTris·HCl（pH7.5）、15mmo1／LNaCl中，配成10mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保留于‐20℃。

[实验步骤]

（一）提取质粒将3mL含Apm的LB液体培育基加入到两支试管中，别离接入含pQE‐31质粒和pUC18‐CAT的大肠杆菌，37℃振荡培育留宿。

以下的操作按试剂盒的说明书进行。

（附试剂盒说明书）

（二）质粒的琼脂糖凝胶电泳

将5mL洗脱液与3mL的DNA样品缓冲液混合，加于1.2%Agarose做凝胶电泳分析。

附：

试剂盒说明书

3SSpinPlasmidMiniprepKitV3．1上海申能博彩生物科技bbst＠shl63．netwww．biocolors

试剂盒组成：

组成K1910（50次）K1920（100次）K1930（250次）

SolutionI（a）5m110m125m1

SolutionII（b）10m120m150ml

Solutionlll20m150m12x50m1

WashSolution（c）22m12x22m15x22m1

TE（d）5m110m140m1

3SColumn50支100支250支

Co11ectiontube50支100支250根

说明书1份1份l份

注：

a）SolutionI内含RNaseA，每次实验终止后，4℃保留。

b）温度低时，SoluionII有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后利用。

c）第一次利用前，必需在WashSolution瓶中加入50ml无水乙醇，充分混勾后利用。

每次利用后将瓶盖旋紧，以维持WashSolution中的乙醇含量。

d）TEpH8．0或水均能够用十洗脱，可是用水洗脱DNA，效率通常要低—些。

抽提测序用质粒需要用水洗脱。

要紧特点：

●采纳改良的碱裂解方式，质量稳固，重复性好。

●经济快速，每一个抽提能够在20分钟内完成。

●无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需CsCl离心。

●质粒纯度高，洗脱体积小，适合于DNA全白动荧光测序。

实验操作步骤（从细菌中抽提质粒）

1．将留宿培育的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，完全去除上清。

2．加入100mlsolutionI，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。

注意：

关于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；质粒若是用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，II和III的用量。

3．加入200mlSolutionII，当即上下倒置或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置（2分钟左右）至溶液变成澄清。

4．加入400mlSolutionIII，当即上卜倒置5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。

注意：

步骤2和3在冰上操作成效更佳。

5．高速离心，15，000转／分钟，10分钟。

无需低温离心。

注意：

提高离心速度，使沉淀加倍紧密，步骤6操作取上清更为方便。

6．掏出2m1样品搜集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全数转移到（吸或倒入）3S柱里。

盖上离心管盖子（盖子也能够不盖，可是若是您同时有很多样品，担忧混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子），室温放置2分钟（室温放置时刻不重要，可长可短）；用台式离心机室温高速（12，000转／分钟）离心1分钟。

注意：

转移上清时不要吸取沉淀，不然会显现GenomicDNA和蛋白质污染。

离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部份溶液从柱子底部流出，为正常现象。

7．取下3S柱，弃去掉搜集管中的废液，将3S柱放入同一支搜集管中，吸取700mlWashSolution到3S柱，离心1分钟。

8．重复步骤7一次。

9．取下3S柱，弃去掉搜集管中的废液，将3S柱放入同—支搜集管中，高速离心2分钟。

10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加50mlTE或水，不要盖上离心管盖,室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。

注意：

将TE或水预热到50℃左右能够提高洗脱效率。

测序用质粒用30ml预热的水洗脱，浓度一样知足测序要求。

11．洗脱的质粒能够当即用于各类分子生物学操作或‐20℃保留备用。

lml留宿培育细胞，质粒若是用50ml水洗脱，通常情形下能够取10ml洗实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳

[实验原理]

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以一样的速度向正极方向移动。

在必然的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也能够分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。

一样提取的质粒有3种构型：

超螺旋的共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA），开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，（opencircularDNA，简称ocDNA），线状质粒DNA，即质粒DNA在同一处两条链都发生断裂（linearDNA，简称LDNA）。

由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往显现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，第二为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器1．恒温培育箱2．琼脂糖凝胶电泳系统3．小型高速离心机4．高压灭菌锅5．紫外核酸检测仪

（二）材料1．pQE‐31和pUC18‐CAT质粒（三）试剂1．50xTAE（50倍体积的TAE贮存液）配1000mL50xTAE：

Tris242g冰醋酸57mL0.5mol／LEDTA200mLpH8.02．凝胶加样缓冲液（6x）溴酚蓝0.25％蔗糖40％3．琼脂糖

4．溴化乙锭溶液（EB）0.5µg／mL

5．250bpDNA分子量标准

[实验步骤]

（一）制备琼脂糖凝胶依照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。

可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度％线性DNA的有效分离范围／kb0.35—600.61——————3

实验用1.2％琼脂糖。

称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，掏出摇匀即可。

（二）胶板的制备

1．取干净的有机玻璃内槽，用透亮胶带将有机玻璃内槽的两头边缘封好（必然封严，不能留裂缝）。

2．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

3．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

4．待胶凝固后，警惕地拔出梳子，撕下透亮胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。

注意：

DNA样品孔应朝向负电极一端。

5．加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1‐1.5毫米。

（三）加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。

（四）电泳

1．接通电泳槽与电泳仪的电源。

DNA的迁移速度与电场强度成正比，一样电场强度不要超过5V／cm。

2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处，停止电泳。

（五）染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液（在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的溴化乙锭贮存液即可），在脱色摇床上缓慢摇动下染色20‐30分钟。

注意：

溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并警惕污染环境。

[实验结果]在紫外灯（360nm或254nm）下观看染色后的电泳凝胶。

DNA存在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观看时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的损害作用）。

脱液做Agarose电泳或酶切分析。

实验四DNA重组

[实验原理]DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，如此从头组合的DNA叫做重组体或重组子。

DNA重组的方式要紧有粘端连接法和平端连接法。

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将别离经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

经常使用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性结尾的DNA分子连在一路，而且能使平结尾的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性结尾的连接效率低，一样可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平结尾的连接效率。

若是是单酶切，为了避免载体本身的自身连接，能够用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处置，去掉酶切后5'端的磷酸。

如此做能有效避免质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。

连接反映的温度在37℃时有利于连接酶的活性，可是在如此的温度下，粘性结尾的氢键结合是不稳固的。

一样的连接条件是在12‐16℃，反映12‐16小时（留宿），如此既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性结尾短暂配对结构的稳固。

连接产物转化宿主细胞后，还须对转化菌落进行挑选鉴定，挑选出所需的重组质粒。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器1．恒温摇床2．恒温水浴3．恒温培育箱4．小型高速离心机

（二）材料1．氨苄青霉素2．BamHI3．HindIII4．T4DNA连接酶5．pQE‐31和pUC18‐CAT质粒6．培育皿7．接种针8．金属涂棒9．1.5mL离心管10．酒精灯11．镊子、灭菌牙签等（三）试剂DNA琼脂糖胶纯化试剂盒（3SSpinDNAAgaroseGelPurificationKit，申能博彩公司）

[实验步骤]

（一）质粒DNA用实验二提取的pQE‐31和pUC18‐CAT质粒。

（二）制备重组DNA1．在灭菌的

1.5mL离心管中，加入pQE‐31质粒10mL（2mg／mL），2mL酶切缓冲液，1mLBamHI和HindIII酶的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7mL，至反映混合物整体积为20mL，离心混匀，37℃反映留宿。

2．在另一无菌1.5mL离心管中，加pUC18‐CAT质粒20mL，加入3mL酶切反映液，lmLBamHI和HindIII酶的混合液，无菌双蒸水补到30mL，37℃反映留宿。

3．反映完毕后取5mLpQE‐31质粒的酶切液做电泳分析，查验酶切是不是完全。

酶切完全，进行下一步。

4．将酶切处置的后pQE‐31和pUC18‐CAT质粒，别离上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加DNA分子量标准）。

电泳终止后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒依照试剂盒说明书的方式回收DNA片段。

前者回收的片段为3.5kb，后者为650bp。

5．将回收的pQE‐31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的CAT片段混合，做连接；另一份不加CAT片段，做对照。

操作如下：

在10mLDNA样品中,加T4DNA连接酶缓冲液1mL，T4DNA连接酶1mL，14℃（室温）留宿，然后做大肠杆菌的转化。

（三）转化感受态细胞1．用实验一制备的感受态细胞（‐20℃保留的）。

2．在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10mL连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参如实验一进行。

同时做未加CAT片段的空白pQE‐31载体质粒连接处置后的感受态细胞转化的对照。

[实验结果]留宿培育后，实验组和对照组的两个培育皿上都可能会显现一些菌落。

若是实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，那么是好征兆，但实验组中显现的菌落是不是含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。