总RNA的提取及相关实验方法.docx

1、总RNA的提取及相关实验方法总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1. 提取组织RNA时，每50100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温1530C下放置5分钟；3. 在上述

2、EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（1530）放置23分钟后，12000g（28）离心15分钟；4. 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（1530）放置10分钟,12000g（28）离心10分钟；5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（28）离心5分钟，弃上清；6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。 PCR 实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa

3、 TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。1. 按下

4、列组成在PCR反应管中调制反应液：TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方ReagentQuantity, for 50l of reaction mixture10X PCR buffer （Mg2+ free）5 lMgCl2（25mM）如TaKaRa TaqTM加3 l 如TaKaRa EXTaqTM加4 l2.5mM dNTP mix4 l 10M Primer 上游1 l10M Primer下游1 lTemplate DNA1 lTaq或EXTaqDNA Polymerase0.25 lSterile deionized waterUp to 50lTotal50

5、 l /SamplePyrobestTM DNA Polymerase的配方ReagentQuantity, for 50l of reaction mixture10X Pyrobest buffer 5l2.5mM dNTP mix4l 10M Primer上游1l10M Primer 下游1lTemplate DNA1lPyrobestTM DNA Polymerase0.25lSterile deionized waterUp to 50lTotal50l /Sample1 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做2050l以节约试剂；2 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的P

6、CR薄壁管中；3 如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 50l 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；2. 按以下程序进行PCR扩增。PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。StepTemperature, C Time, minNumber of cyclesNote起始变性94951-31变性94950.5-225-35退火温度比理论退火温度大概低5C，再根据反应结果优化退火37-700.5-2延伸70-75根据扩增产物的大小每分钟延伸1000bp最终延伸70-75101反应结束后，抽取扩增样品5l，用琼脂糖凝胶

7、电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。RT-PCRProtocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) 1. 按下列组成在PCR反应管中调制反应液ReagentQuantity, for 50lof reaction mixture10One Step RNA PCR Buffer5l25 mM MgCl210l10 mM dNTP mix5lRNase Inhibitor (40 U/l)1lAMV-Optimized Taq1lAMV RTase XL (5 U/l)1l上游特异Primer (20 M)1

8、l下游特异Primer (20 M)1l实验样品RNA（1 g Total RNA）1lRNase Free dH2O24lTotal50l /Sample1. 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做2050l以节约试剂；2. 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；3. 如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 50l 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；2 按以下条件进行反应StepTemperature, CTime, minNumber of cyclesNote逆转录50301逆转录酶失活9421变性940.525-35退火37-650.5退火温度比

9、理论退火温度大概低5C，再根据反应结果优化延伸72根据扩增产物的大小Taq酶每分钟延伸1000bp最终延伸72101反应结束后，抽取扩增样品5l，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。琼脂糖核酸电泳1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2. 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般2030 ml）；3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其

10、凝固；4. 室温下3045分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6. 在DNA样品中加入10体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7. 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60100V电压，电泳2040min即可；8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大

11、小。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,000胶回收纯化DNA1. 琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；2. 按照每100mg加400l的量加入binding buffer，放入到EP管振荡器中，4555温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；3. 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm 离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放

12、回EP管中；4. 加500l的wash buffer至柱中，8,000rpm 离心1分钟。弃管中的溶液；5. 重复操作4步的操作1次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，除去痕量的wash buffer；6. 将纯化柱放入一个新的EP管。加3040l H2O或者elution buffer至纯化柱膜的中央，在37或50下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20保存。7. 注：若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100l液量加400l的binding buffer,其余的步骤不变。血清制备1. 取血后，37oC下，让血

13、液凝固1到2小时（不加抗凝剂）；2. 4oC冰箱过夜（让血块固缩）；3. 当血清自然析出后， 4oC，3000转/分，离心10分钟，分离血清，弃去不溶物；4. 将血清移至一干净试管，并分装成小份，储藏在-80oC。ELISA一、包被抗原1. 用50mM的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为10-20 g/ml，加100 l/孔到96孔酶标板，4 oC放置过夜。2. 第二天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150 l 1 BSA 37 oC封闭1小时。3. PBST洗涤3次后，每孔加入100 l不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 oC孵育2小时。4. PBST洗

14、涤5次后，加入100l稀释后的HRP标记的二抗，37 oC孵育1小时。5. PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A405吸收值。二、包被细胞1. 在96孔培养板上接种细胞数为1 x 104 cells/well，37过夜培养。2. 第二天用PBS洗涤培养板2-3次。3. 加入125 l/well 10% Formalin（1:10稀释）, 室温下固定15 min。4. 用ddH2O洗涤培养板3次，并晾干，储藏在2-8oC备用。5. 用PBST洗涤3次，每孔加入150 l 1 BSA 37 oC封闭1小时。6. PBST洗涤3次后，每孔加入100 l不同倍比稀释度的血清，并

15、加入对照样品，37 oC孵育2小时。7. PBST洗涤5次后，加入100 l稀释后的HRP标记的二抗,37 oC孵育1小时。8. PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A405吸收值。 50mM的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4，保存,Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。 ABTS作为底物进行显色反应(10ml)： 0.2M Na2HPO4 2.4ml 0.1M 柠檬酸2.6ml ddH2O 5ml ABTS 5mg H2O2(30%) 4 ul（用前加入）注 意： 一般做倍比稀释进行检测，需要有相

16、应的对照血清。 不同的显色系统对应不同的光吸收值。组织病理技术组织处理：1. 取新鲜组织厚度不超过5mm，10% 中性福尔马林固定，大于24小时。2. 固定后冲水12-24小时，3. 75%酒精， 1次，1小时，4. 85%酒精， 1次，1小时，5. 95%酒精， 3次，1小时，6. 100%酒精， 3次，1小时，7. 二甲苯， 2次，1小时，8. 石蜡浸泡， 3次，2小时，HE 染色： 水化1. 二甲苯， 2次，5-10分钟，2. 100%酒精， 1次，1-2 分钟，3. 95%酒精， 1次，1-2 分钟，4. 85%酒精， 1次，1-2 分钟，5. 75%酒精， 1次，1-2 分钟，6.

17、过蒸馏水， 染色1. Mayer 氏苏木素，1 分钟，2. 温水冲洗， 5-10 分钟，3. 75% 盐酸酒精， 1-2 分钟，4. 自来水冲洗， 30 秒钟，5. 依红复染， 1-2 分钟，6. 自来水洗， 30 秒钟，7. 85%酒精， 1次，1-2 分钟，8. 95%酒精， 2次，1-2 分钟，9. 100%酒精， 2次，1-2 分钟，10. 二甲苯， 2次，5-10分钟，11. 中性树胶封片。免疫组化染色一石蜡切片免疫组化染色实验步骤： 1石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60 1小时）。 （1）二甲苯、II,各10分钟。 （2）梯度酒精：100%，2分钟 95%，2分钟 80%，

18、2分钟 70%2分钟。 （3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。 2过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟（避光）。 3蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。 4抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。附：抗原修复液（10mM pH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制 （1）储备液的配制： A液：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000ml B液：枸橼酸 21g + 蒸馏水1000ml （2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸馏水900ml 抗原修复的方法：（1） 高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖 上锅盖，高压

19、锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。（2） 微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档,5分钟.（最佳温度为9295） （3）酶消化处理：此略。 抗原修复的注意事项： （1）组织不能干。 （2）选择抗原修复方法要因抗体而异。 （3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。 （4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。 5PBS：5分钟，2次（置于摇床）。 6正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织 周围的水分

20、（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗 体 同源动物血清）处理，37，15分钟。 附：正常血清配制 (或按试剂盒规定的浓度配制) 按1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50l+5l (10%抛洒量)计算。 7滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37 2小时 （也可置于4冰箱过夜）。 8PBS：5分钟，2次（置于摇床）。 9滴加生物素化的二抗，37，40分钟。 10PBS：5分钟，2次（置于摇床）。 11滴加三抗 （SAB复合物），37，40分钟。 12PBS：5分钟，2次（置于摇床）。 13DAB 显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。 附：DAB

21、的配制（1） 储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成 1ml,100l,50l，20l等，20，冻存。 （2）工作液：DAB 储备液20l + PBS 1000l + 3% H2O2 5l 14自来水（细水）充分冲洗。 15苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。 16自来水冲洗返蓝，15分钟。 17梯度酒精脱水： 80%，2分钟 95%，2分钟 100%，2次，5分钟。 18二甲苯透明： I，（二甲苯）各5分钟 19封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤： 样品制备 电泳分

22、离 蛋白的膜转移 免疫杂交与显色蛋白检测溶液和试剂 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于 25C), 2% w/v SDS, 10%甘

23、油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3) 10X Tris缓冲盐 (TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为 7.6 脱脂奶粉或BSA 甲醇 TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20 封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% BSA (多抗)或 5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般

24、来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。1 培养细胞或药物处理。2 弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。3 加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 l /w或 75 cm2 plate, 500-1000 l/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。4 超声 1015秒剪切

25、DNA以减低样品粘性。5 煮沸样品5 minutes。6 离心12000g, 5 min，取上清。7 电泳分离：上样15l20 l 至 SDS-PAGE 胶 (10 cm x 10 cm)电泳。如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150 cm2 flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀415min，14000g离心15min（4），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。注意：一般

26、上样2030 g已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100g，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）转膜杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白

27、分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45m和0.2m两种规格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2m的膜了，如用0.45m的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。注

28、意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。3. 装配转移三明治：海绵3层滤纸胶膜3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜免疫杂交与显色1 用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。2 置膜于25 ml 封闭缓冲液中1h,

29、室温，摇动。3 15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。4 加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4C过夜，缓慢摇动。5 15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。6 加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。7 15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。8 15 ml TBS洗1次。9 蛋白检测(显色法或发光法，按相应试剂说明操作)。注意事项：1 操作中戴手套，不要用手触膜。2 PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。3 如检测小于20kD的蛋白应用0.2m的膜，并可省略转移时的平衡步骤。4 某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此时可用1.0% BSA代替Tween-20。5 关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.33% BSA in PBS：低的内源性交叉反应性。6 如用0. 1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。7 如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。