总RNA的提取及相关实验方法.docx
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总RNA的提取及相关实验方法
总RNA的提取（Trizol法提取）
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1mlTrizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；
3.在上述EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；
4.取上层水相置于新EP管中,按照每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；
5.弃上清，按照每1mlTRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；
6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
7.用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。
PCR
实验室常用DNA聚合酶有三种：
TaKaRaTaqTM，TaKaRaEXTaqTM和PyrobestTMDNAPolymerase。
TaKaRaTaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。
TaKaRaEXTaqTM是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。
PyrobestTMDNAPolymerase也是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。
如果进行基因的扩增请使用此酶。
1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液：
TaKaRaTaqTM或TaKaRaEXTaqTM的配方
Reagent
Quantity,for50µlofreactionmixture
10XPCRbuffer（Mg2+free）
5µl
MgCl2（25mM）
如TaKaRaTaqTM加3µl
如TaKaRaEXTaqTM加4µl
2.5mMdNTPmix
4µl
10µMPrimer上游
1µl
10µMPrimer下游
1µl
TemplateDNA
1µl
Taq或EXTaqDNAPolymerase
0.25µl
Steriledeionizedwater
Upto50µl
Total
50µl/Sample
PyrobestTMDNAPolymerase的配方
Reagent
Quantity,for50µlofreactionmixture
10XPyrobestbuffer
5µl
2.5mMdNTPmix
4µl
10µMPrimer上游
1µl
10µMPrimer下游
1µl
TemplateDNA
1µl
PyrobestTMDNAPolymerase
0.25µl
Steriledeionizedwater
Upto50µl
Total
50µl/Sample
1反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；
2将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；
3如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30~50µl的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；
2.按以下程序进行PCR扩增。
PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。
Step
Temperature,°C
Time,min
Numberofcycles
Note
起始变性
94~95
1-3
1
变性
94~95
0.5-2
25-35
退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化
退火
37-70
0.5-2
延伸
70-75
根据扩增产物的大小
每分钟延伸1000bp
最终延伸
70-75
10
1
反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
RT-PCR
Protocol:
TaKaRaOneStepRNAPCRKit（AMV）
1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液
Reagent
Quantity,for50µl
ofreactionmixture
10×OneStepRNAPCRBuffer
5µl
25mMMgCl2
10µl
10mMdNTPmix
5µl
RNaseInhibitor（40U/µl）
1µl
AMV-OptimizedTaq
1µl
AMVRTaseXL（5U/µl）
1µl
上游特异Primer（20µM）
1µl
下游特异Primer（20µM）
1µl
实验样品RNA（≤1µgTotalRNA）
1µl
RNaseFreedH2O
24µl
Total
50µl/Sample
1.反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；
2.将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；
3.如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30~50µl的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；
2．按以下条件进行反应
Step
Temperature,°C
Time,min
Numberofcycles
Note
逆转录
50
30
1
逆转录酶失活
94
2
1
变性
94
0.5
25-35
退火
37-65
0.5
退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化
延伸
72
根据扩增产物的大小
Taq酶每分钟延伸1000bp
最终延伸
72
10
1
反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
琼脂糖核酸电泳
1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；
2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：
准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30ml）；
3.放入到微波炉内加热熔化。
冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；
4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；
5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；
6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loadingbuffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；
7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）。
一般60～100V电压，电泳20～40min即可；
8.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；
9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围
琼脂糖凝胶浓度
线形DNA的最佳分辨范围（bp）
0.5%
1,000～30,000
0.7%
800～12,000
1.0%
500～10,000
1.2%
400～7,000
1.5%
200～3,000
2.0%
50～2,000
胶回收纯化DNA
1.琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；
2.按照每100mg加400µl的量加入bindingbuffer，放入到EP管振荡器中，45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；
3.取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；
4.加500µl的washbuffer至柱中，8,000rpm离心1分钟。
弃管中的溶液；
5.重复操作4步的操作1次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，除去痕量的washbuffer；
6.将纯化柱放入一个新的EP管。
加30~40µlH2O或者elutionbuffer至纯化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。
7.注：
若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100µl液量加400µl的bindingbuffer,其余的步骤不变。
血清制备
1.取血后，37oC下，让血液凝固1到2小时（不加抗凝剂）；
2.4oC冰箱过夜（让血块固缩）；
3.当血清自然析出后，4oC，3000转/分，离心10分钟，分离血清，弃去不溶物；
4.将血清移至一干净试管，并分装成小份，储藏在-80oC。
ELISA
一、包被抗原
1.用50mM的碳酸盐包被缓冲液（pH9.6）溶解抗原，使抗原浓度为10-20μg/ml，加100μl/孔到96孔酶标板，4oC放置过夜。
2.第二天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150μl1％BSA37oC封闭1小时。
3.PBST洗涤3次后，每孔加入100μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37oC孵育2小时。
4.PBST洗涤5次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗，37oC孵育1小时。
5.PBST洗涤5次后，显色剂显色20min后，酶标仪上读取A405吸收值。
二、包被细胞
1.在96孔培养板上接种细胞数为1x104cells/well，37℃过夜培养。
2.第二天用PBS洗涤培养板2-3次。
3.加入125µl/well10%Formalin（1:
10稀释）,室温下固定15min。
4.用ddH2O洗涤培养板3次，并晾干，储藏在2-8oC备用。
5.用PBST洗涤3次，每孔加入150μl1％BSA37oC封闭1小时。
6.PBST洗涤3次后，每孔加入100μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37oC孵育2小时。
7.PBST洗涤5次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗,37oC孵育1小时。
8.PBST洗涤5次后，显色剂显色20min后，酶标仪上读取A405吸收值。
50mM的碳酸盐包被缓冲液：
0.05mol/LpH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存, Na2CO30.15克,NaHCO30.293克,蒸馏水稀释至100ml。
ABTS作为底物进行显色反应（10ml）：
✧0.2MNa2HPO42.4ml
✧0.1M柠檬酸2.6ml
✧ddH2O5ml
✧ABTS5mg
✧H2O2（30%）4ul（用前加入）
注意：
✧一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。
✧不同的显色系统对应不同的光吸收值。
组织病理技术
组织处理：
1.取新鲜组织厚度不超过5mm，10%中性福尔马林固定，大于24小时。
2.固定后冲水12-24小时，
3.75%酒精，1次，1小时，
4.85%酒精，1次，1小时，
5.95%酒精，3次，1小时，
6.100%酒精，3次，1小时，
7.二甲苯，2次，1小时，
8.石蜡浸泡，3次，2小时，
HE染色：
{水化}
1.二甲苯，2次，5-10分钟，
2.100%酒精，1次，1-2分钟，
3.95%酒精，1次，1-2分钟，
4.85%酒精，1次，1-2分钟，
5.75%酒精，1次，1-2分钟，
6.过蒸馏水，
{染色}
1.Mayer氏苏木素，1分钟，
2.温水冲洗，5-10分钟，
3.75%盐酸酒精，1-2分钟，
4.自来水冲洗，30秒钟，
5.依红复染，1-2分钟，
6.自来水洗，30秒钟，
7.85%酒精，1次，1-2分钟，
8.95%酒精，2次，1-2分钟，
9.100%酒精，2次，1-2分钟，
10.二甲苯，2次，5-10分钟，
11.中性树胶封片。
免疫组化染色
一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：
1．石蜡切片脱蜡至水：
（石蜡切片染色前应置60℃1小时）。
（1）二甲苯、II,各10分钟。
（2）梯度酒精：
100%，2分钟95%，2分钟80%，2分钟70%2分钟。
（3）蒸馏水洗：
5分钟，2次（置于摇床）。
2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：
3%H2O2，室温10分钟（避光）。
3．蒸馏水洗：
5分钟，2次（置于摇床）。
4．抗原修复：
根据待检测的抗原，选择适当的方法。
附：
抗原修复液（10mMpH6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制
（1）储备液的配制：
A液：
枸橼酸三钠-2H2O29.41g+蒸馏水1000ml
B液：
枸橼酸21g+蒸馏水1000ml
（2）工作液的配制：
A液82ml+B液18ml+蒸馏水900ml
抗原修复的方法：
（1）高压锅处理技术：
枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖上锅盖，高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。
（2）微波处理技术:
用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档,5分钟.（最佳温度为9295℃）
（3）酶消化处理：
此略。
抗原修复的注意事项：
（1）组织不能干。
（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。
（3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
（4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。
5．PBS：
5分钟，2次（置于摇床）。
6．正常血清封闭：
从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织
周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。
附：
正常血清配制（或按试剂盒规定的浓度配制）
按1:
20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50l+5l（10%抛洒量）计算。
7．滴加第一抗体：
用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃2小时
（也可置于4℃冰箱过夜）。
8．PBS：
5分钟，2次（置于摇床）。
9．滴加生物素化的二抗，37℃，40分钟。
10．PBS：
5分钟，2次（置于摇床）。
11．滴加三抗（SAB复合物），37℃，40分钟。
12．PBS：
5分钟，2次（置于摇床）。
13．DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。
附：
DAB的配制
（1）储备液（DAB25mg/ml）的配制：
DAB250mg+PBS10ml，待完全溶解后分装成1ml,100l,50l，20l等，—20℃，冻存。
（2）工作液：
DAB储备液20l+PBS1000l+3%H2O25l
14．自来水（细水）充分冲洗。
15．苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。
16．自来水冲洗返蓝，15分钟。
17．梯度酒精脱水：
80%，2分钟95%，2分钟100%，2次，5分钟。
18．二甲苯透明：
I，
（二甲苯）各5分钟
19．封片：
加拿大树胶（或中性树胶）封片。
WesternBlot（免疫印迹法）
主要包括以下4个基本步骤：
⏹样品制备
⏹电泳分离
⏹蛋白的膜转移
⏹免疫杂交与显色――蛋白检测
溶液和试剂
⏹1X磷酸盐缓冲液（PBS）
⏹ModifiedRIPAbuffer
Tris-HCl:
50mM,pH7.4;NP-40:
1%;Na-deoxycholate:
0.25%;NaCl:
150mM;EDTA:
1mM;PMSF:
1mM;Aprotinin,leupeptin,pepstatin:
1microgram/mleach;Na3VO4:
1mM;NaF:
1mM
⏹1XSDS样品缓冲液
62.5mMTris-HCl（pH6.8于25°C）,2%w/vSDS,10%甘油,50mMDTT,0.01%w/v溴酚蓝
⏹转移缓冲液
25mMTrisbase,0.2M甘氨酸,20%甲醇（pH8.3）
⏹10XTris缓冲盐（TBS）
准备1L10XTBS:
24.2gTrisbase,80gNaCl;用1NHCl调pH为7.6
⏹脱脂奶粉或BSA
⏹甲醇
⏹TBS/T缓冲液
1XTBS,0.1%Tween-20
⏹封闭缓冲液（TBS/T）
1XTBS,0.1%Tween-20加5%w/v脱脂奶粉或BSA
⏹一抗的稀释
1XTBS,0.1%Tween-20加5%BSA（多抗）或5%脱脂奶粉（单抗）
Note:
一般来说,BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
⏹预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率
样品制备
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1XPBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3．加入1XSDS样品缓冲液（6-wellplate,100µl/w或75cm2plate,500-1000µl/瓶），刮落细胞，转移到Ep管。
注意：
冰上操作。
4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。
5．煮沸样品5minutes。
6．离心12000g,5min，取上清。
7．电泳分离：
上样15µl~20µl至SDS-PAGE胶（10cmx10cm）电泳。
如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液（1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask）裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。
注意：
一般上样20~30µg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100µg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。
电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）
转膜
杂交膜的选择是决定Westernblot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Westernblot的膜主要有两种：
硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45µm和0.2µm两种规格的NC膜。
大于20kD的蛋白可用0.45µm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2µm的膜了，如用0.45µm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
蛋白质常用的转移方法主要有两种：
槽式湿转和半干转移。
前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。
以下为槽式湿转的操作步骤。
1.将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。
注意：
如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
2.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。
如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。
3.装配转移三明治：
海绵3层滤纸胶膜3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。
切记：
胶放于负极面（黑色面）。
4.将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
注意：
应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。
5.转膜结束后，切断电源，取出杂交膜
免疫杂交与显色
1．用25mlTBS洗膜5min，室温，摇动。
2．置膜于25ml封闭缓冲液中1h,室温，摇动。
3．15mlTBS/T洗3次（5min/T）。
4．加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。
5．15mlTBS/T洗3次（5min/T）。
6．加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。
7．15mlTBS/T洗3次（5min/T）。
8．15mlTBS洗1次。
9．蛋白检测（显色法或发光法，按相应试剂说明操作）。
注意事项：
1．操作中戴手套，不要用手触膜。
2．PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。
3．如检测小于20kD的蛋白应用0.2µm的膜，并可省略转移时的平衡步骤。
4．某些抗原和抗体可被Tween-20洗脱，此时可用1.0%BSA代替Tween-20。
5．关于封闭剂的选择：
5%脱脂奶/TBSorPBS:
能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.3~3%BSAinPBS：
低的内源性交叉反应性。
6．如用0.1%Tween20、0.02%NaN3inPBSorTBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。
7．如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。
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