不同碳氮浓度对苏云金芽胞杆菌的影响.docx

1、不同碳氮浓度对苏云金芽胞杆菌的影响不同碳氮浓度对苏云金芽胞杆菌的影响 毕艳梅 陈忆摘要：确定不同浓度培养基成分对苏云金芽孢杆菌发酵的影响。实验结果表明，不同浓度培养基成分配比对苏云金芽孢杆菌生长影响差别很大，2%的碳浓度对苏云金芽孢杆菌生长较好，不同的豆饼粉对苏云摘要：研究不同碳氮浓度对苏云金芽孢杆菌生长情况的影响，对苏云金芽孢杆菌液态发酵培养基进行优化，将发酵产品干燥粉碎后制成菌悬液，通过测量其吸光度来金芽孢生长影响不大。利用蒽酮硫酸法测定培养基中糖的含量，分光光度计测定吸光值，在一定范围内吸光度与糖浓度呈线性比例Outline:Suresomemediumcomponentswithdif

2、ferentconcentrations of the influence of bacillus fermentation. Experimental results show that different concentration distribution medium into some bacillus than 2% growth influenced differenceisverybig,thecarbon concentration on some bacillus grew more good, different DouBing powder on SuYun the c

3、arbon and nitrogen: different concentration of some bacillus, the influence of the growth of some bacillus liquid fermentation, will optimize dry fermentation products made after smashing suspension liquid, as measured by bacteria its absorbency to gold spores little effects on growth. Using the det

4、ermination of anthraquinone ketone sulfuric acid medium sugar content, absorb the light spectrophotometer to measure values, within the scope of certain and absorbency and sugar concentration linear proportion。 关键字：苏云金芽孢杆菌 芽孢率 蒽酮硫酸法 分光光度计Keywords: some bacillus spores rate anthracene ketone hydrate-

5、sulfuric s前言：苏云金芽孢杆菌(简称Bt)是目前世界上生产和使用量最大的生物杀虫剂，属革兰氏阳性菌。在稳定生长期可形成半胞晶体，又称杀虫晶体蛋白。与化学杀虫剂相比，苏云金芽孢杆菌对营养物质的要求不高，0075OI 225 、含糖01 15 和糖氮比0442O0的环境下就能很好地生长 ，但是选合适的碳源、氮源和无机盐以及它们之间的比例直接影响到目标产物伴孢晶体的产生 。目前BT发酵培养基配方主要有玉米粉，酵母粉，豆饼粉，面粉，鱼粉以及其他一些因素，但由于配比的不合适，使得Bt伴胞晶体含量不高调整培养基中各种物质的配比，可以改善细菌生长条件，提高BT伴胞晶体含量。1 材料与方法苏云金芽孢

6、杆菌：由合肥工业大学生物与食品工程实验室提供。1.1.碳源单因子发酵培养基：面粉（0.5%，1%，2%） 豆饼粉0.5% 硫酸二氢铵0.04% 磷酸二氢钾0.04% 硫酸镁0.01% 酵母粉1.6%1.2.氮源单因子发酵培养基豆饼粉（0.3%，0.5%，0.7%） 面粉1% 硫酸二氢铵0.02% 磷酸二氢钾0.04% 硫酸镁0.01% 酵母粉1%1.3.液体种子培养基 牛肉膏蛋白冻培养基1.4.发酵条件 250ml三脚瓶装30ml培养基, 初始pH78 高压灭菌121 20 m in. 以体积分数为1% 接种量转接液体菌种, 置于28 , 200 r/m in 的摇床内进行发酵培养; 92 h

7、 后对发酵液中的芽孢含量进行测定.1.5.培养基的优化 通过单因子实验确定苏云金芽孢杆菌培养基的最适碳氮源浓度, 影响芽孢产量的重要因子, 再通过梯度实验法和平板涂布法分析对重要因子的水平进行优化1.6.水平设计 不同浓度的培养基共六个锥形瓶实验中要有无菌意识，无菌做的好坏是影响实验质量的重要因素分别取10-8 10-9 10-10三个浓度测定发酵液芽孢量变化趋势. 1.7.涂抹平板计数法 先在每一灭菌平皿中倾注15ml左右的固体培养基，制成平板，做好标记，每个稀释度三个平行，然后用无菌吸管吸取0.1ml样品稀释液对号接种在不同稀释度的培养皿中的琼脂平板上，然后分别用无菌玻璃涂抹棒将稀释液涂布

8、均匀，平放桌上约2030分钟，使稀释液渗透于培养基中，然后将培养皿倒置，37培养，至长出菌落即可计数。1.8.芽孢量测定 用孔雀绿将菌液进行染色,在用番红复染 芽孢被染成绿色，营养体是红色的色, 在显微镜下观察计数。1.9.蒽酮硫酸法测定糖的浓度 根据比例计算取76.74ml硫酸，31.8ml水2g蒽酮配制0.2%蒽酮硫酸溶液测定吸光度2结果与分析2.1不同碳浓度对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响，用培养基1进行实验对苏云金芽孢杆菌进行发酵培养,三种浓度的培养皿标号为A1，B1,C 1结果表明3种碳浓度都能促进该菌的生长并产生芽孢. 其中以面粉质量为0.6g时面粉培养基芽孢产量最多, 结果见图1.

9、 图1 A1 B 1 C12.2 不同氮源对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响以面粉作为碳源, 分别以0.09g 0.15g 0.21g的豆饼粉为氮源,标号为A2，B2，C2 进行单因子实验. 在培养过程中苏云金芽孢杆菌生长良好, 各种培养基组合都有芽孢产生, 但在芽孢产量0.15g豆饼粉中生长最好大, 结果如下图2所示. 图2 A 2 B2 C2本次实验中遇到了好多问题，碳组实验基本成功菌数生长清晰，氮组实验失败了，做了10-6 10-7 10-8三个梯度的平板培养，培养出来的菌数生长太旺盛，几乎布满了培养皿表面，菌数那么多的原因是我们在做试管梯度的时候，每次往试管中加1ml的菌液后摇匀不充分;另

10、一原因是酵母粉的加入也起了氮浓度的作用，氮浓度增大了，菌落数目增多；实验的精密度也不高，我们的实验技能不够熟练。第一次配蒽酮硫酸溶液，由于硫酸的质量百分数搞错了，取了98%，配出来的溶液颜色不对，无法测定吸光值。总的来说第一次实验基本失败。周五晚上六点我们小组决定重做实验，周五晚上把我们一个大组的两百多支试管，几十个培养皿，和若干移液管洗净，包扎，消毒，周六上午开始做梯度实验，24小时以后去看菌落生长情况，测吸光度，制片。周一下午再测一次吸光度。吸光度如下表格，实验过程中能够曾把辛辛苦苦制好的片随便放以致被同学的衣袖扫到地上去了，好心疼，但是晚了。这件事告诉我，做事不要那么马虎，不然会给自己带

11、来很多麻烦。周一下午实验基本结束了，第二次实验生长的菌数还是较多，但是比第一次好一点，重做实验测出来的吸光度就比较合理2.3表1 吸光度测定结果 项目实验次数面粉不同含量（g）豆饼粉不同含量（g）0.150.30.60.090.150.21第一次0.0340.0560.1260.0980.0640.074第二次0.0170.0300.0750.0740.0380.034差值0.0170.0260.0510.0240.0260.043 从吸光度的差值可以看出糖的利用率情况。取10-2浓度的菌液制玻片，芽孢的生长情况如图所示 A1 A2 A3 B1 B2 B3 苏云金芽孢杆菌被革兰氏碘液染成蓝色属

12、阳性菌苏云金芽孢染色结果致谢：感谢杨老师的悉心指导和合理的实验策划。感谢老师们给我们做好实验的所有准备、提供了许多方便，也感谢跟我一起进行实验的陈忆同学。在你们的竭诚帮助下，使我的实验能够顺利完成，对于你们为我所做的一切，我深表感谢！参考文献：1 杨梅,张峰,苏新华等. 苏云金芽孢杆菌LLB19 发酵培养基的优化. 福建师范大学学报。2009, 3:75-812 Schnepf E, Crickmore N. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins J. Microbiology and Molecular Biol

13、ogy Review s, 1998, 62 (3): 775- 806.3 朱玮,赵兵,王晓东等. 生物农药苏云金芽孢杆菌的研究进展J . 过程工程学报, 2004, 4 (3) : 282- 288.4 关雄. 苏云金芽孢杆菌研究回顾与展望J . 中国农业科技导报,2006,8 (6): 5- 11.5 吴继星,谢天健,陈在佴,等. 苏云金杆菌8521026 (s) 发酵培养基的筛选J. 微生物学通报,1988,15(6): 254- 256.6 黄天培, 邱思鑫, 黄志鹏, 等. 苏云金杆菌摇瓶发酵培养基J . 福建农林大学学报: 自然科学版, 2002,31(3): 317- 319.7 常亚飞, 陈守文, 喻子牛. 苏云金素发酵培养基的优化设计J . 中国生物防治, 2006,22(3): 190- 194.8 郑毅, 周堍, 黄勤清, 等. 产耐温蛋白酶苏云金芽孢杆菌FS140 液体发酵条件优化J. 应用与环境生物学报,2007,13(5):708-