大肠菌群计数方法作业指导书.docx

1、大肠菌群计数方法作业指导书文件修改记录版本修订次数修订日期修 订 内 容002011-02-14 A12012-05-25 修订分发号 : _(仅适用于控制文件)(仅盖有红色印章的文件才有效)1.0目的规定大肠杆菌计数的方法。2.0适用范围适用于加多宝凉茶、浓缩汁或原辅材料中的大肠杆菌群的计数。3.0术语3.1大肠菌群：一群在36条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧格兰仕隐形无芽孢杆菌。3.2MPN最可能数（most probable number）：基于泊松分布的一种间接计数方法。4.0职责4.1质检部：负责按此方法对加多宝来凉茶、浓缩汁或原辅材料中大肠菌群进行计数。5.0流

2、程图见附录A、附录B。6.0内容及要求6.1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：6.1.1恒温培养箱：3616.1.2冰箱：2-56.1.3恒温水浴箱：4616.1.4天平：感量0.1g6.1.5振荡器6.1.6无菌吸管：1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸头。6.1.7无菌锥形瓶：容量500ml6.1.8无菌试管：18200ml6.1.9小导管6.1.10 无菌培养皿：直径90mm6.1.11 菌落计数器6.2培养基和试剂6.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤6.2.2煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤6.2.3乳糖胆盐发酵培养基（

3、LBB）6.2.4乳糖蛋白胨培养基（LPB）6.2.5伊红美蓝琼脂培养基（EMB）6.2.6结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）6.2.775%乙醇溶液6.2.8无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121高压灭菌15min6.3大肠菌群MPN计数法6.3.1加多宝凉茶、浓缩汁等产品及原辅材料中大肠菌群的测定6.3.1.1样品稀释a、固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。b、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1：10的样

4、品匀液。c、用1ml无菌吸管吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注入盛有9ml无菌生理盐水的试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制成1：100的样品匀液。d、根据对样品污染状况的分析，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。注意每递增稀释一次，换用一支1ml无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。6.3.1.2初发酵试验a、每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如果接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）。b、将以上接种好的试管置于361培养

5、242h，观察导管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至482h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。6.3.1.3复发酵试验用接种环从所有482h内发酵产气的LST肉汤中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，361培养482h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.3.1.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告 根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录C），报告每克（或每毫升）样品中大肠菌群的MPN值。6.3.2工艺水等水样中大肠菌群的测定6.3.2.1推测性试验a、取待检样品10ml，接种到10ml双料的乳糖

6、胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培养液中，共接种5管；对于可能存在污染的水源，取待检样品10ml、1ml、0.1ml（取样品1ml于9ml无菌生理盐水中稀释，取稀释后的样液1ml），分别接种于含10ml双料、单料和单料乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培养液中，各接种5管。b、如果水样污染较严重，应加大稀释度，可接种1ml、0.1ml、0.01ml甚至0.1ml、0.01ml、0.001ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1ml以下水样时，必须做10倍递增稀释后，取1ml接种，每递增稀释一次，换用1支1ml无菌刻度吸管。c、将以上接种好的试管置于361培养箱内培养242h，如所有乳糖胆盐

7、发酵管或乳糖蛋白胨发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。6.3.2.2确证性试验6.3.2.2.1方法一a、分离培养将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置于361生化培养箱内，培养18-24h取出。观察菌落形态，用接种环挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。1菌落呈深紫黑色，表面有金属光泽；2紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；3淡紫红色、中心较深的菌落。b、证实试验经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖胆盐发酵管内，置于361生化培养箱培养242h，有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。6.3.2.2.2方法二自推测性检验阳性

8、管中取1接种环培养液，接种到煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤管中，置于361培养箱内培养48h。观察BGLG管中的产气情况，如有气体产生，就可确定为大肠菌群阳性，如无气体产生则为大肠菌群阴性。6.3.2.3结果报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，可得出水样中大肠菌群的MPN 值。5管法见附录F，15管法结果见附录E。稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数。如所有乳糖胆盐发酵管均为阴性时，可报告大肠菌群未检出。6.4大肠菌群平板计数法6.4.1样品稀释按6.3.1.1执行6.4.2平板计数6.4.2.1选取1-3个适宜的稀释度（液体样品可以选用原液）接种两个无菌平皿，每皿1ml，同时分

9、别取1ml无菌生理盐水加入到两个无菌平皿作空白对照。6.4.2.2及时将冷却至46的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）15-20ml倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后再加3-4ml结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）覆盖平板表层。翻转平板，置于361培养箱内培养18-24h。6.4.2.3用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。选取菌落数在15CFU-150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑的大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.55mm或更大。6.4.3证实试验 从VRBA平板上挑取1

10、0个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，361培养箱内培养24-48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。6.4.4平板计数法的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以6.4.2.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或每毫升）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1ml，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100（6/10）104 g（ml） = 6.0105 CFU/g （CFU/ml）7.0质量记录7.1 KJWIF-QA-34 成品检测记录附录A大

11、肠菌群MPN计数检验程序附录大肠菌群平板计数检验程序附录C大肠菌群最可能数（MPN）检索表每克（或每毫升）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见下表：阳性管数MPN95%可信限阳性管数MPN95%可信限0.10.010.001下限上限0.10.010.001下限上限0001100420注1：本表采用3个稀释度0.1g（或0.1ml）、0.01g（或0.01ml）和0.001g（或0.001ml），每个稀释度接种3管。注2：表内所列检样量如改用1g（或1ml）、0.1g（或0.1ml）和0.01g（或0.01ml）时，表内数字应相应降低10倍，如改用0.01g（或0.01ml）、0.001g（或0.001ml）、0.0001g（或0.0001ml）时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。附录D大肠菌群MPN检索表（用5管10ml水样时各种阳性和阴性结果组合的MPN值及其95%的可信限）阳性反应管数MPN/100ml95%可信限下限上限000612.20.112.625.10.519.239.21.629.44163.352.9516 8无限附录E大肠菌群MPN检索表（总接种量55.5ml，其中5份10ml水样，5份1ml水样，5份0.1ml水样）接种量/ml大肠菌