大肠菌群计数方法作业指导书.docx
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大肠菌群计数方法作业指导书
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2011-02-14
A
1
2012-05-25
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分发号:
______（仅适用于控制文件）
（仅盖有红色印章的文件才有效）
1.0目的
规定大肠杆菌计数的方法。
2.0适用范围
适用于加多宝凉茶、浓缩汁或原辅材料中的大肠杆菌群的计数。
3.0术语
3.1大肠菌群：
一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧格兰仕隐形无芽孢杆菌。
3.2MPN最可能数（mostprobablenumber）：
基于泊松分布的一种间接计数方法。
4.0职责
4.1质检部：
负责按此方法对加多宝来凉茶、浓缩汁或原辅材料中大肠菌群进行计数。
5.0流程图
见附录A、附录B。
6.0内容及要求
6.1设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：
6.1.1恒温培养箱：
36℃±1℃
6.1.2冰箱：
2℃-5℃
6.1.3恒温水浴箱：
46℃±1℃
6.1.4天平：
感量0.1g
6.1.5振荡器
6.1.6无菌吸管：
1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸头。
6.1.7无菌锥形瓶：
容量500ml
6.1.8无菌试管：
18×200ml
6.1.9小导管
6.1.10无菌培养皿：
直径90mm
6.1.11菌落计数器
6.2培养基和试剂
6.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤
6.2.2煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤
6.2.3乳糖胆盐发酵培养基（LBB）
6.2.4乳糖蛋白胨培养基（LPB）
6.2.5伊红美蓝琼脂培养基（EMB）
6.2.6结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
6.2.775%乙醇溶液
6.2.8无菌生理盐水：
称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min
6.3大肠菌群MPN计数法
6.3.1加多宝凉茶、浓缩汁等产品及原辅材料中大肠菌群的测定
6.3.1.1样品稀释
a、固体和半固体样品：
称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：
10的样品匀液。
b、液体样品：
以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1：
10的样品匀液。
c、用1ml无菌吸管吸取1：
10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注入盛有9ml无菌生理盐水的试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制成1：
100的样品匀液。
d、根据对样品污染状况的分析，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。
注意每递增稀释一次，换用一支1ml无菌吸管。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
6.3.1.2初发酵试验
a、每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如果接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）。
b、将以上接种好的试管置于36±1℃培养24±2h，观察导管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48±2h。
记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。
未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
6.3.1.3复发酵试验
用接种环从所有48±2h内发酵产气的LST肉汤中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察产气情况。
产气者，计为大肠菌群阳性管。
6.3.1.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告
根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录C），报告每克（或每毫升）样品中大肠菌群的MPN值。
6.3.2工艺水等水样中大肠菌群的测定
6.3.2.1推测性试验
a、取待检样品10ml，接种到10ml双料的乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培养液中，共接种5管；对于可能存在污染的水源，取待检样品10ml、1ml、0.1ml（取样品1ml于9ml无菌生理盐水中稀释，取稀释后的样液1ml），分别接种于含10ml双料、单料和单料乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培养液中，各接种5管。
b、如果水样污染较严重，应加大稀释度，可接种1ml、0.1ml、0.01ml甚至0.1ml、0.01ml、0.001ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。
接种1ml以下水样时，必须做10倍递增稀释后，取1ml接种，每递增稀释一次，换用1支1ml无菌刻度吸管。
c、将以上接种好的试管置于36±1℃培养箱内培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管或乳糖蛋白胨发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
6.3.2.2确证性试验
6.3.2.2.1方法一
a、分离培养
将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置于36±1℃生化培养箱内，培养18-24h取出。
观察菌落形态，用接种环挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。
1菌落呈深紫黑色，表面有金属光泽；
2紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；
3淡紫红色、中心较深的菌落。
b、证实试验
经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖胆盐发酵管内，置于36±1℃生化培养箱培养24±2h，有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。
6.3.2.2.2方法二
自推测性检验阳性管中取1接种环培养液，接种到煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤管中，置于36±1℃培养箱内培养48h。
观察BGLG管中的产气情况，如有气体产生，就可确定为大肠菌群阳性，如无气体产生则为大肠菌群阴性。
6.3.2.3结果报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，可得出水样中大肠菌群的MPN值。
5管法见附录F，15管法结果见附录E。
稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数。
如所有乳糖胆盐发酵管均为阴性时，可报告大肠菌群未检出。
6.4大肠菌群平板计数法
6.4.1样品稀释按6.3.1.1执行
6.4.2平板计数
6.4.2.1选取1-3个适宜的稀释度（液体样品可以选用原液）接种两个无菌平皿，每皿1ml，同时分别取1ml无菌生理盐水加入到两个无菌平皿作空白对照。
6.4.2.2及时将冷却至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）15-20ml倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后再加3-4ml结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）覆盖平板表层。
翻转平板，置于36±1℃培养箱内培养18-24h。
6.4.2.3用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。
选取菌落数在15CFU-150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑的大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.55mm或更大。
6.4.3证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养箱内培养24-48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
6.4.4平板计数法的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以6.4.2.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或每毫升）样品中大肠菌群数。
例：
10-4样品稀释液1ml，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
100×（6/10）×104g（ml）=6.0×105CFU/g（CFU/ml）
7.0质量记录
7.1KJWIF-QA-34《成品检测记录》
附录A
大肠菌群MPN计数检验程序
附录Ｂ
大肠菌群平板计数检验程序
附录C
大肠菌群最可能数（MPN）检索表
每克（或每毫升）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见下表：
阳性管数
MPN
95%可信限
阳性管数
MPN
95%可信限
0.1
0.01
0.001
下限
上限
0.1
0.01
0.001
下限
上限
0
0
0
<3.0
—
9.5
2
2
0
21
4.5
42
0
0
1
3.0
0.15
9.6
2
2
1
28
8.7
94
0
1
0
3.0
0.15
11
2
2
2
35
8.7
94
0
1
1
6.1
1.2
18
2
3
0
29
8.7
94
0
2
0
6.2
1.2
18
2
3
1
36
8.7
94
0
3
0
9.4
3.6
38
3
0
0
23
4.6
94
1
0
0
3.6
0.17
18
3
0
1
38
8.7
110
1
0
1
7.2
1.3
18
3
0
2
64
17
180
1
0
2
11
3.6
38
3
1
0
？
9
180
1
1
0
7.4
1.3
20
3
1
1
75
17
200
1
1
1
11
3.6
38
3
1
2
120
37
420
1
2
0
11
3.6
42
3
1
3
160
40
420
1
2
1
15
4.5
42
3
2
0
93
18
420
1
3
0
16
4.5
42
3
2
1
150
37
420
2
0
0
9.2
1.4
38
3
2
2
210
40
430
2
0
1
14
3.6
42
3
2
3
290
90
1000
2
0
2
20
4.5
42
3
3
0
240
42
1000
2
1
0
15
3.7
42
3
3
1
460
90
2000
2
1
1
20
4.5
42
3
3
2
1100
180
4100
2
1
2
27
8.7
94
3
3
3
>1100
420
—
注1：
本表采用3个稀释度［0.1g（或0.1ml）、0.01g（或0.01ml）和0.001g（或0.001ml）］，每个稀释度接种3管。
注2：
表内所列检样量如改用1g（或1ml）、0.1g（或0.1ml）和0.01g（或0.01ml）时，表内数字应相应降低10倍，如改用0.01g（或0.01ml）、0.001g（或0.001ml）、0.0001g（或0.0001ml）时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。
附录D
大肠菌群MPN检索表
（用5管10ml水样时各种阳性和阴性结果组合的MPN值及其95%的可信限）
阳性反应管数
MPN/100ml
95%可信限
下限
上限
0
0
0
6
1
2.2
0.1
12.6
2
5.1
0.5
19.2
3
9.2
1.6
29.4
4
16
3.3
52.9
5
>16
8
无限
附录E
大肠菌群MPN检索表（总接种量55.5ml，其中5份10ml水样，5份1ml水样，5份0.1ml水样）
接种量/ml
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