玉环县疾病预防控制中心作业指导书.docx

1、玉环县疾病预防控制中心作业指导书玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2 版，共 26 页 第 1 页1 目的与适用范围本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准适用于食品和食物中毒样品中各类微生物的检验。2染色液配制及染色法2.1革兰氏染色法（可按成品试剂上的说明操作）2.1.1结晶紫染色液结晶紫1g 95%乙醇 20mL1%草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。2.1.2革兰氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。2.1.3

2、沙黄复染液沙黄 0.25g95%乙醇10mL蒸馏水 90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。2.1.4染色法2.1.4.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。2.1.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。2.1.4.3滴加95%乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇 滴满整个涂片，脱色10s。2.1.4.4水洗，滴加复染液，复染1min。水洗，待干，镜检。2.1.5结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。2.2 吉氏染色法（可按成品试剂上的说明操作）吉氏粉 0.5g中性甘

3、油 25mL甲醇 25mL将染粉加少量甘油研磨，边研边加，至甘油加完为止，倾入100mL玻塞瓶内，加入甘油，塞紧瓶塞，充分摇匀，置室温下35天，即为原液，临用时稀释。2.2.4 染色法2.2.4.1将血片用甲醇固定约1 min。2.2.4.2滴加10%染液染45 min。水洗，待干，镜检。2.3 硼砂美蓝染色法玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2 版，共 26 页 第 2 页2.3.1硼砂 3g2.3.2美蓝 2g置研钵内,边研边加水,待溶解后冲入瓶中,加蒸馏水100mL配成原液,过滤后备用.染色时取原液5mL，加清水配成稀释液。2.3

4、.3 染色法血片染35 min，使血膜呈天蓝色，水洗，待干，镜检。2.4耐酸性染色法(萎倪二氏法) （可按成品试剂上的说明操作）2.4.1石炭酸品红染色液碱性品红 0.3g 95%乙醇 10mL5%酚水溶液 90mL将品红溶解于乙醇中，然后与酚溶液混合。2.4.23%盐酸乙醇浓盐酸 3mL95%乙醇 97mL2.4.3复染液吕氏碱性美蓝染色液。2.4.4染色法2.4.4.1将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。染液如因蒸发减少时，应随时添加。染5min，倾去染液，水洗。2.4.4.2滴加盐酸乙醇脱色，直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定，一般

5、为13min)，水洗。2.4.4.3滴加吕氏碱性美蓝染色液，复染30s1min，水洗，待干，镜检。2.4.5结果：耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。3生化试验培养基和试剂3.1 生理盐水氯化钠 8.5g 蒸馏水1000mL溶解后，分装121高压灭菌20min。3.2磷酸盐缓冲液3.2.1储存液磷酸二氢钾34g1mol/L氢氧化钠溶液 175mL蒸馏水825mL3.2.2制法先将磷酸盐溶解于500mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液校正pH7.2后，再用蒸馏水稀释至1000mL。3.2.3稀释液：取储存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL。分装每瓶100mL或每管10mL，

6、121高压灭菌15min。3.3 75%乙醇玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2 版，共 26 页 第 3 页95%乙醇 790mL蒸馏水210mL混匀后备用。3.4蛋白胨水(靛基质试验用) （可用微量发酵管）3.4.1成分蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g氯化钠 5g蒸馏水 1000mLpH7.43.4.2制法按上述成分配制，分装小试管，121高压灭菌15min。3.4.3靛基质试剂（可按成品试剂上的说明操作）3.4.3.1柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL。3.4.3.2欧波试剂：将1g对二

7、甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。3.4.4试验方法挑取小量培养物接种，在361培养12d，必要时可培养45d。加入柯凡克试剂约0.5mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。3. 5尿素琼脂（可用微量发酵管）3.5.1成分蛋白胨 1g氯化钠 5g葡萄糖 1g磷酸二氢钾 2g0.4%酚红溶液 3mL琼脂 20g蒸馏水 1000mL20%尿素溶液 100mLpH7.20.13.5.2制法将除尿素和琼

8、脂以外的成分配好，并校正pH，加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121高压灭菌15min。冷至5055，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%，最终pH应为7.20.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用。3.5.3试验方法挑取琼脂培养物接种，在361培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2 版，共 26 页 第 4 页 3.6氰化钾(KCN)培养基（可按成品试剂上的说明操作或者用微量发酵管）3.6.1成分蛋白胨 10g氯化钠 5g磷酸二氢钾 0.225g磷酸氢二钠 5.64g蒸

9、馏水 1000mL0.5%氰化钾溶液 20mLpH7.63.6.2制法将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为110000)，分装于12mm100mm灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放在4冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。3.6.3试验方法将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在361培养12d，观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制)，经2d细菌不生长为

10、阴性(抑制)。注：氰化钾是剧毒药物，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。 3.7氨基酸脱羧酶试验培养基（可用微量发酵管）3.7.1成分蛋白胨5g酵母浸膏3g葡萄糖1g蒸馏水1000mL1.6%滇甲酚紫乙醇溶液1mLL氨基酸或DL氨基酸 0.5或1g/100mLpH6.83.7.2制法除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L氨基酸按0.5%加入，DL氨基酸按1%加入。再行

11、校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115高压灭菌10min。3.7.3试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于361培养1824h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。3.8糖发酵管（可用微量发酵管）玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2 版，共 26 页 第 5 页 3.8.1成分牛肉膏 5g蛋白胨 10g氯化钠 3g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 2g0.2%滇麝香草酚蓝溶液 1

12、2mL蒸馏水 1000mLpH7.43.8.2制法3.8.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121高压灭菌15min。3.8.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。3.8.3试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于361培养，一般观察23d。迟缓反应需观察1430d。3.9ONPG培养基（可用微量发酵管）3.9.1成分邻硝基酚D

13、-半乳糖昔(ONPG) 60mg(ONitrophenylDgalactopyranoside)0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5) 10mL1%蛋白胨水(PH7.5)30mL3.9.2制法将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mm75mm试管，每管0.5mL，用橡皮塞塞紧。3.9.3试验方法自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于361培养13h和24h观察结果。如果半乳糖苷酶产生，则于13h变黄色，如无此酶则24h不变色。 3.10丙二酸钠培养基（可用微量发酵管）3.10.1成分酵母浸膏 1g硫酸铵 2g磷酸氢二钾 0.6g磷酸二氢钾 0.4g氯化钠 2g丙二酸

14、钠 3g0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL蒸馏水 1000mLpH6.8玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2 版，共 26 页 第 6 页3.10.2制法先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加入指示剂，分装试管，121高压灭菌15min。3.10.3试验方法用新鲜的琼脂培养物接种，于361培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。3.11葡葡糖铵培养基（可按成品试剂上的说明操作）3.11.1成分氯化钠5g硫酸镁(MgSO47H2O) 0.2g磷酸二氢铵1g磷酸氢二钾1g葡萄糖2g琼脂20g蒸馏水1000mL0.2%溴麝香草酚蓝溶液

15、40mLpH6.83.11.2制法先将盐类和糖溶解于水内，校正pH，再加琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121高压灭菌15min，放成斜面。3.11.3试验方法用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以每一接种环内含菌数在20100之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。于361培养24h。阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长；阴性者不生长，但在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。注：容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使

16、用。如果操作时不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。 3.12西蒙氏柠檬酸盐培养基（可用微量发酵管）3.12.1成分氯化钠5g硫酸镁(MgSO47H2O)0.2g磷酸二氢铵1g磷酸氢二钾1g柠檬酸钠5g琼脂20g蒸馏水1000mL0.2%溴麝香草酚蓝溶液40mLpH6.83.12.2制法 先将盐类溶解于水内，校正pH，再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2 版，共 26 页 第 7 页分装试管，121高压灭菌15min。放成斜面。3.12.3试验方法挑取少量琼脂培养物接种，于361培养4d

17、，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。 3.13氧化酶试验（可用纸片法）3.13.1试剂3.13.1.11%盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制，干冰箱内避光保存。3.13.1.21%-萘酚乙醇溶液。3.13.2试验方法3.13.2.1取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深；再加-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。3.13.2.2以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。3.14甲基红(MR)试验（可按成品试剂上的说明操作）自琼脂斜面挑取少量培养物接种缓冲葡萄糖蛋白胨水中，于36

18、1培养25d，哈夫尼亚菌则应在2225培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法：10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。3.15VP试验（可按成品试剂上的说明操作）用琼脂培养物接种缓冲葡萄糖蛋白胨水培养基中，于361培养24d。哈夫尼亚菌则应在2225培养。加入6%萘酚乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在361下培养4h再进行观察。3.16 0.25%氯化钙氯化钙 2.5 g 蒸馏水 1000 mL3.17缓冲葡萄糖蛋白胨水 （可用微量发酵管）

19、3.17.1成分磷酸氢二钾 5g多胨 7g葡萄糖 5g蒸馏水 1000mLpH7.03.17.2制法溶化后校正pH，分装试管，每管1mL，121高压灭菌15min。3.18 3%过氧化氢溶液30%过氧化氢溶液临用时稀释10倍。3.19 20%碳酸钠溶液碳酸钠 20g灭菌蒸馏水 100mL3.20 甘露醇发酵培养基（可用微量发酵管）玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2 版，共 26 页 第 8 页3.20.1成分牛肉膏 5g甘露醇 10g蛋白胨 10g氯化钠 5g0.2%麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水 1000mL3.20.2制法 将蛋白胨

20、、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，校正pH7.4后，加入甘露醇和指示剂，分装试管，121高压灭菌20min。 3.21 1.5%硫代硫酸钠硫代硫酸钠 15g蒸馏水 1000mL121高压灭菌20min。3.22 10%硫代硫酸钠硫代硫酸钠 100g蒸馏水 1000mL121高压灭菌20min。3.23 0.1%硫代硫酸钠肉汤硫代硫酸钠 1g肉汤 1000mL121高压灭菌20min。3.24 3%(W/V)吐温80和0.3%卵磷脂肉汤吐温80 30g卵磷脂 3g肉汤 1000mL121高压灭菌20min。3.25 0.3%甘氨酸肉汤甘氨酸 3g肉汤 1000mL115高压灭菌15min。

21、3.26 3%(W/V)吐温80吐温80 30g肉汤 1000mL121高压灭菌20min。4一般培养基和专用培养基4.1营养琼脂（可按成品试剂上的说明操作）4.1.1成分蛋白胨 10g牛肉膏 3g 玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2 版，共 26 页 第 9 页氯化钠 5g琼脂 1520g蒸馏水 1000mL4.1.2制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.27.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121高压灭菌15min。注：此培养基可供一般细菌培养之用，可倾注平板或制成斜面

22、。如用于菌落计数，琼脂量为1.5%；如作成平板或斜面，则应为2%。 4.2乳糖胆盐发酵管（可按成品试剂上的说明操作） 4.2.1成分 蛋白胨20g 猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g 乳糖10g 0.04%滇甲酚紫水溶液 25mL 蒸馏水1000mL pH7.4 4.2.2制法 将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒管，115高压灭菌15min。注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。4.3伊红美蓝琼脂(EMB) （可按成品试剂上的说明操作）4.3.1成分蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 17g2%伊红Y溶液20mL0.65%美蓝溶液

23、10mL蒸馏水 1000mLpH7.14.3.2制法将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正PH，分装于烧瓶内，121高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至5055，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。 4.4乳糖发酵管（可用微量发酵管） 4.4.1成分 蛋白胨20g 乳糖10g 0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL 蒸馏水1000mL玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2 版，共 26 页 第 10 页pH7.44.4.2制法将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30mL、10mL或3mL，并放

24、入一个小倒管，115高压灭菌15min。注：双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。4.5EC肉汤（可按成品试剂上的说明操作）4.5.1成分胰蛋白胨20g3号胆盐(或混合胆盐) 1.5g乳糖5g磷酸氢二钾4g磷酸二氢钾1.5g氯化钠5g蒸馏水1000mL4.5.2制法将上述成分混合，溶解后，分装有发酵倒管的试管中，121高压灭菌15min，最终pH为6.90.2。4.6缓冲蛋白胨水(BP) （可用微量发酵管）4.6.1成分蛋白胨 10g氯化钠 5g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 9g磷酸二氢钾 1.

25、5g蒸馏水 1000mLpH7.24.6.2制法按上述成分配好后以大烧瓶装，121高压灭菌15min。临用时无菌分装每瓶225mL。注：本培养基供沙门氏菌前增菌用。4.7氯化镁孔雀绿增菌液(MM) （可按成品试剂上的说明操作）4.7.1甲液胰蛋白胨 5g氯化钠 8g磷酸二氢钾 1.6g蒸馏水 1000mL4.7.2乙液氯化镁(化学纯) 40g蒸馏水 100mL4.7.3丙液玉环县疾病预防控制中心作业指导书文件编号：YJKZ/ZYW6-001标题：试剂配制版号：第 2 版，共 26 页 第 11 页0.4%孔雀绿水溶液。4.7.4制法分别按上述成分配好后，121高压灭菌15min备用。临用时取甲液90mL、乙液9mL、丙液0.9mL，以无菌操作混合即可。注：本培养基亦称Rappaport 10(R10)增菌液。4.8亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC) （可按成品试剂上的说明操作）4.8.1