玉环县疾病预防控制中心作业指导书.docx
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玉环县疾病预防控制中心作业指导书
玉环县疾病预防控制中心作业指导书
文件编号:
YJKZ/ZYW6-001
标题:
试剂配制
版号:
第2版,共26页第1页
1目的与适用范围
本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。
本标准适用于食品和食物中毒样品中各类微生物的检验。
2 染色液配制及染色法
2.1 革兰氏染色法(可按成品试剂上的说明操作)
2.1.1 结晶紫染色液
结晶紫 1g
95%乙醇 20mL
1%草酸铵水溶液 80mL
将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
2.1.2 革兰氏碘液
碘 1g
碘化钾 2g
蒸馏水 300mL
将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。
2.1.3 沙黄复染液
沙黄 0.25g
95%乙醇 10mL
蒸馏水 90mL
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
2.1.4 染色法
2.1.4.1 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。
2.1.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
2.1.4.3 滴加95%乙醇脱色,约30s;或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色10s。
2.1.4.4 水洗,滴加复染液,复染1min。
水洗,待干,镜检。
2.1.5 结果
革兰氏阳性菌呈紫色。
革兰氏阴性菌呈红色。
注:
亦可用1:
10稀释石炭酸复红染色液作复染液,复染时间仅需10s。
2.2吉氏染色法 (可按成品试剂上的说明操作)
吉氏粉0.5g
中性甘油25mL
甲醇25mL
将染粉加少量甘油研磨,边研边加,至甘油加完为止,倾入100mL玻塞瓶内,加入甘油,塞紧瓶塞,充分摇匀,置室温下3~5天,即为原液,临用时稀释。
2.2.4染色法
2.2.4.1将血片用甲醇固定约1min。
2.2.4.2滴加10%染液染45min。
水洗,待干,镜检。
2.3硼砂美蓝染色法
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YJKZ/ZYW6-001
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试剂配制
版号:
第2版,共26页第2页
2.3.1硼砂3g
2.3.2美蓝2g
置研钵内,边研边加水,待溶解后冲入瓶中,加蒸馏水100mL配成原液,过滤后备用.染色时取原液5mL,加清水配成稀释液。
2.3.3染色法
血片染3~5min,使血膜呈天蓝色,水洗,待干,镜检。
2.4 耐酸性染色法(萎-倪二氏法)(可按成品试剂上的说明操作)
2.4.1 石炭酸品红染色液
碱性品红 0.3g
95%乙醇 10mL
5%酚水溶液 90mL
将品红溶解于乙醇中,然后与酚溶液混合。
2.4.2 3%盐酸-乙醇
浓盐酸 3mL
95%乙醇 97mL
2.4.3 复染液
吕氏碱性美蓝染色液。
2.4.4 染色法
2.4.4.1 将涂片在火焰上加热固定,滴加石炭酸品红染色液,徐徐加热至有蒸气出现,但切不可使沸腾。
染液如因蒸发减少时,应随时添加。
染5min,倾去染液,水洗。
2.4.4.2 滴加盐酸-乙醇脱色,直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定,一般为1~3min),水洗。
2.4.4.3 滴加吕氏碱性美蓝染色液,复染30s~1min,水洗,待干,镜检。
2.4.5 结果:
耐酸性细菌呈红色,其他细菌、细胞等物质呈蓝色。
3 生化试验培养基和试剂
3.1生理盐水
氯化钠8.5g
蒸馏水 1000mL
溶解后,分装121℃高压灭菌20min。
3.2 磷酸盐缓冲液
3.2.1 储存液
磷酸二氢钾 34g
1mol/L氢氧化钠溶液 175mL
蒸馏水 825mL
3.2.2 制法
先将磷酸盐溶解于500mL蒸馏水中,用1mol/L氢氧化钠溶液校正pH7.2后,再用蒸馏
水稀释至1000mL。
3.2.3 稀释液:
取储存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL。
分装每瓶100mL或每管10mL,121℃高压灭菌15min。
3.375%乙醇
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YJKZ/ZYW6-001
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试剂配制
版号:
第2版,共26页第3页
95%乙醇790mL
蒸馏水 210mL
混匀后备用。
3.4 蛋白胨水(靛基质试验用)(可用微量发酵管)
3.4.1 成分
蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000mL
pH7.4
3.4.2 制法
按上述成分配制,分装小试管,121℃高压灭菌15min。
3.4.3 靛基质试剂(可按成品试剂上的说明操作)
3.4.3.1 柯凡克试剂:
将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。
然后缓慢加入
浓盐酸25mL。
3.4.3.2 欧-波试剂:
将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。
然后缓慢加
入浓盐酸20mL。
3.4.4 试验方法
挑取小量培养物接种,在36±1℃培养1~2d,必要时可培养4~5d。
加入柯凡克试剂
约0.5mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约0.5mL,沿管壁流下,
覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注:
蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。
每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。
3.5 尿素琼脂(可用微量发酵管)
3.5.1 成分
蛋白胨 1g
氯化钠 5g
葡萄糖 1g
磷酸二氢钾 2g
0.4%酚红溶液 3mL
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
20%尿素溶液 100mL
pH7.2±0.1
3.5.2制法
将除尿素和琼脂以外的成分配好,并校正pH,加入琼脂,加热溶化并分装烧瓶。
121℃
高压灭菌15min。
冷至50~55℃,加入经除菌过滤的尿素溶液。
尿素的最终浓度为2%,最终pH应为7.2±0.1。
分装于灭菌试管内,放成斜面备用。
3.5.3 试验方法
挑取琼脂培养物接种,在36±1℃培养24h,观察结果。
尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
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试剂配制
版号:
第2版,共26页第4页
3.6 氰化钾(KCN)培养基(可按成品试剂上的说明操作或者用微量发酵管)
3.6.1 成分
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
磷酸二氢钾 0.225g
磷酸氢二钠 5.64g
蒸馏水 1000mL
0.5%氰化钾溶液 20mL
pH7.6
3.6.2 制法
将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶,121℃高压灭菌15min。
放在冰箱内使其充分冷却。
每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为1∶10000),分装于12mm×100mm灭菌试管,每管约4mL,立刻用灭菌橡皮塞塞紧,放在4℃冰箱内,至少可保存两个月。
同时,将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。
3.6.3 试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取1环接种于氰化钾(KCN)培养基。
并另挑取1环接种于对照培养基。
在36±1℃培养1~2d,观察结果。
如有细菌生长即为阳性(不抑制),经2d细菌不生长为阴性(抑制)。
注:
氰化钾是剧毒药物,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。
夏天分装培养基应在冰箱内进行。
试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。
试验时对每一环节都要特别注意。
3.7 氨基酸脱羧酶试验培养基(可用微量发酵管)
3.7.1 成分
蛋白胨 5g
酵母浸膏 3g
葡萄糖 1g
蒸馏水 1000mL
1.6%滇甲酚紫-乙醇溶液 1mL
L-氨基酸或DL-氨基酸 0.5或1g/100mL
pH6.8
3.7.2 制法
除氨基酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100mL,分别加入各种氨基酸:
赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。
L-氨基酸按0.5%加入,DL-氨基酸按1%加入。
再行校正pH至6.8。
对照培养基不加氨基酸。
分装于灭菌的小试管内,每管0.5mL,上面滴加一层液体石蜡,115℃高压灭菌10min。
3.7.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种,于36±1℃培养18~24h,观察结果。
氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱,培养基应呈紫色。
阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。
对照管应为黄色。
3.8 糖发酵管(可用微量发酵管)
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YJKZ/ZYW6-001
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试剂配制
版号:
第2版,共26页第5页
3.8.1 成分
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
氯化钠 3g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 2g
0.2%滇麝香草酚蓝溶液 12mL
蒸馏水 1000mL
pH7.4
3.8.2 制法
3.8.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后,按0.5%加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内,121℃高压灭菌15min。
3.8.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min。
另将各种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。
将5mL糖溶液加入于100mL培养基内,以无菌操作分装小试管。
注:
蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。
3.8.3 试验方法:
从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,于36±1℃培养,一般观察2~3d。
迟缓反应需观察14~30d。
3.9 ONPG培养基(可用微量发酵管)
3.9.1 成分
邻硝基酚β-D-半乳糖昔(ONPG) 60mg
(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)
0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5) 10mL
1%蛋白胨水(PH7.5) 30mL
3.9.2 制法
将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于10mm×75mm试管,每管0.5mL,用橡皮塞塞紧。
3.9.3 试验方法
自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种,于36±1℃培养1~3h和24h观察结果。
如果β-半乳糖苷酶产生,则于1~3h变黄色,如无此酶则24h不变色。
3.10 丙二酸钠培养基(可用微量发酵管)
3.10.1 成分
酵母浸膏 1g
硫酸铵 2g
磷酸氢二钾 0.6g
磷酸二氢钾 0.4g
氯化钠 2g
丙二酸钠 3g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL
蒸馏水 1000mL
pH6.8
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YJKZ/ZYW6-001
标题:
试剂配制
版号:
第2版,共26页第6页
3.10.2 制法
先将酵母浸膏和盐类溶解于水,校正pH后再加入指示剂,分装试管,121℃高压灭菌15min。
3.10.3 试验方法
用新鲜的琼脂培养物接种,于36±1℃培养48h,观察结果。
阳性者由绿色变为蓝色。
3.11 葡葡糖铵培养基(可按成品试剂上的说明操作)
3.11.1 成分
氯化钠 5g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g
磷酸二氢铵 1g
磷酸氢二钾 1g
葡萄糖 2g
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 40mL
pH6.8
3.11.2 制法
先将盐类和糖溶解于水内,校正pH,再加琼脂,加热溶化,然后加入指示剂,混合均匀后分装试管,121℃高压灭菌15min,放成斜面。
3.11.3 试验方法
用接种针轻轻触及培养物的表面,在盐水管内做成极稀的悬液,肉眼观察不见混浊,以每一接种环内含菌数在20~100之间为宜。
将接种环灭菌后挑取菌液接种,同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。
于36±1℃培养24h。
阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长;阴性者不生长,但在对照培养基上生长良好。
如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。
注:
容器使用前应用清洁液浸泡。
再用清水、蒸馏水冲洗干净,并用新棉花做成棉塞,干热灭菌后使用。
如果操作时不注意,有杂质污染时,易造成假阳性的结果。
3.12 西蒙氏柠檬酸盐培养基(可用微量发酵管)
3.12.1 成分
氯化钠 5g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g
磷酸二氢铵 1g
磷酸氢二钾 1g
柠檬酸钠 5g
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 40mL
pH6.8
3.12.2 制法
先将盐类溶解于水内,校正pH,再加琼脂,加热溶化。
然后加入指示剂,混合均匀后
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YJKZ/ZYW6-001
标题:
试剂配制
版号:
第2版,共26页第7页
分装试管,121℃高压灭菌15min。
放成斜面。
3.12.3 试验方法
挑取少量琼脂培养物接种,于36±1℃培养4d,每天观察结果。
阳性者斜面上有菌落生长,培养基从绿色转为蓝色。
3.13 氧化酶试验(可用纸片法)
3.13.1 试剂
3.13.1.1 1%盐酸二甲基对苯二胺溶液:
少量新鲜配制,干冰箱内避光保存。
3.13.1.2 1%α-萘酚-乙醇溶液。
3.13.2 试验方法
3.13.2.1 取白色洁净滤纸沾取菌落。
加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴,阳性者呈现粉红色,并逐渐加深;再加α-萘酚溶液一滴,阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。
阴性于两分钟内不变色。
3.13.2.2 以毛细吸管吸取试剂,直接滴加于菌落上,其显色反应与以上相同。
3.14甲基红(MR)试验(可按成品试剂上的说明操作)
自琼脂斜面挑取少量培养物接种缓冲葡萄糖蛋白胨水中,于36±1℃培养2~5d,哈夫尼亚菌则应在22~25℃培养。
滴加甲基红试剂一滴,立即观察结果。
鲜红色为阳性,黄色为阴性。
甲基红试剂配法:
10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中,然后加入20mL蒸馏水。
3.15 V-P试验(可按成品试剂上的说明操作)
用琼脂培养物接种缓冲葡萄糖蛋白胨水培养基中,于36±1℃培养2~4d。
哈夫尼亚菌则应在22~25℃培养。
加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL,充分振摇试管,观察结果。
阳性反应立刻或于数分钟内出现红色,如为阴性,应放在36±1℃下培养4h再进行观察。
3.160.25%氯化钙
氯化钙2.5g
蒸馏水1000mL
3.17 缓冲葡萄糖蛋白胨水(可用微量发酵管)
3.17.1 成分
磷酸氢二钾 5g
多胨 7g
葡萄糖 5g
蒸馏水 1000mL
pH7.0
3.17.2 制法
溶化后校正pH,分装试管,每管1mL,121℃高压灭菌15min。
3.183%过氧化氢溶液
30%过氧化氢溶液临用时稀释10倍。
3.1920%碳酸钠溶液
碳酸钠20g
灭菌蒸馏水 100mL
3.20甘露醇发酵培养基(可用微量发酵管)
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文件编号:
YJKZ/ZYW6-001
标题:
试剂配制
版号:
第2版,共26页第8页
3.20.1成分
牛肉膏 5g
甘露醇10g
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
0.2%麝香草酚蓝溶液 12mL
蒸馏水 1000mL
3.20.2 制法
将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中,加热溶解,校正pH7.4后,加入甘露醇和指示剂,分装试管,121℃高压灭菌20min。
3.211.5%硫代硫酸钠
硫代硫酸钠15g
蒸馏水 1000mL
121℃高压灭菌20min。
3.2210%硫代硫酸钠
硫代硫酸钠100g
蒸馏水 1000mL
121℃高压灭菌20min。
3.230.1%硫代硫酸钠肉汤
硫代硫酸钠1g
肉汤 1000mL
121℃高压灭菌20min。
3.243%(W/V)吐温80和0.3%卵磷脂肉汤
吐温8030g
卵磷脂3g
肉汤 1000mL
121℃高压灭菌20min。
3.250.3%甘氨酸肉汤
甘氨酸3g
肉汤 1000mL
115℃高压灭菌15min。
3.263%(W/V)吐温80
吐温8030g
肉汤 1000mL
121℃高压灭菌20min。
4 一般培养基和专用培养基
4.1 营养琼脂(可按成品试剂上的说明操作)
4.1.1 成分
蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
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文件编号:
YJKZ/ZYW6-001
标题:
试剂配制
版号:
第2版,共26页第9页
氯化钠 5g
琼脂 15~20g
蒸馏水 1000mL
4.1.2 制法
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2mL,校正pH至
7.2~7.4。
加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化。
分装烧瓶,121℃高压灭菌15min。
注:
此培养基可供一般细菌培养之用,可倾注平板或制成斜面。
如用于菌落计数,琼
脂量为1.5%;如作成平板或斜面,则应为2%。
4.2 乳糖胆盐发酵管(可按成品试剂上的说明操作)
4.2.1 成分
蛋白胨 20g
猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g
乳糖 10g
0.04%滇甲酚紫水溶液 25mL
蒸馏水 1000mL
pH7.4
4.2.2 制法
将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,分装每管10mL,并放入
一个小倒管,115℃高压灭菌15min。
注:
双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外,其他成分加倍。
4.3 伊红美蓝琼脂(EMB)(可按成品试剂上的说明操作)
4.3.1 成分
蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
琼脂 17g
2%伊红Y溶液 20mL
0.65%美蓝溶液 10mL
蒸馏水 1000mL
pH7.1
4.3.2 制法
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中,校正PH,分装于烧瓶内,121℃高压灭菌
15min备用。
临用时加入乳糖并加热溶化琼脂,冷至50~55℃,加入伊红和美蓝溶液,摇匀,倾注平板。
4.4 乳糖发酵管(可用微量发酵管)
4.4.1 成分
蛋白胨 20g
乳糖 10g
0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL
蒸馏水 1000mL
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标题:
试剂配制
版号:
第2版,共26页第10页
pH7.4
4.4.2 制法
将蛋白胨及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,按检验要求分装30mL、10mL
或3mL,并放入一个小倒管,115℃高压灭菌15min。
注:
①双料乳糖发酵管除蒸馏水外,其他成分加倍。
②30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用,3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。
4.5 EC肉汤(可按成品试剂上的说明操作)
4.5.1 成分
胰蛋白胨 20g
3号胆盐(或混合胆盐) 1.5g
乳糖 5g
磷酸氢二钾 4g
磷酸二氢钾 1.5g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000mL
4.5.2 制法
将上述成分混合,溶解后,分装有发酵倒管的试管中,121℃高压灭菌15min,最终pH为6.9±0.2。
4.6 缓冲蛋白胨水(BP)(可用微量发酵管)
4.6.1 成分
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 9g
磷酸二氢钾 1.5g
蒸馏水 1000mL
pH7.2
4.6.2 制法
按上述成分配好后以大烧瓶装,121℃高压灭菌15min。
临用时无菌分装每瓶225mL。
注:
本培养基供沙门氏菌前增菌用。
4.7 氯化镁孔雀绿增菌液(MM)(可按成品试剂上的说明操作)
4.7.1 甲液
胰蛋白胨 5g
氯化钠 8g
磷酸二氢钾 1.6g
蒸馏水 1000mL
4.7.2 乙液
氯化镁(化学纯) 40g
蒸馏水 100mL
4.7.3 丙液
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YJKZ/ZYW6-001
标题:
试剂配制
版号:
第2版,共26页第11页
0.4%孔雀绿水溶液。
4.7.4 制法
分别按上述成分配好后,121℃高压灭菌15min备用。
临用时取甲液90mL、乙液9mL、丙液0.9mL,以无菌操作混合即可。
注:
本培养基亦称Rappaport10(R10)增菌液。
4.8 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)(可按成品试剂上的说明操作)
4.8.1