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1、PopSetGo to:LOCUS FJ839727 4230 bp DNA linear BCT 14-SEP-2009DEFINITION Escherichia coli strain NE037 RhsA （rhsA） gene, complete cds.ACCESSION FJ839727VERSION FJ839727.1 GI:239877791KEYWORDS .SOURCE Escherichia coliORGANISM Escherichia coli Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacter

2、iales;Enterobacteriaceae; Escherichia.REFERENCE 1 （bases 1 to 4230） AUTHORS Liu,K., Knabel,S.J. and Dudley,E.G. TITLE rhs genes are potential markers for multilocus sequence typing of Escherichia coli O157:H7 strains JOURNAL Appl. Environ. Microbiol. 75 （18）, 5853-5862 （2009） PUBMED 19633111REFERENC

3、E 2 （bases 1 to 4230） TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted （18-MAR-2009） Food Science, The Pennsylvania State University, 326 Food Science Building, University Park, PA 16802, USAFEATURES Location/Qualifierssource 1.4230 /organism=Escherichia coli /mol_type=genomic DNA /strain=NE037 /db_xref=ta

4、xon:562gene 1.4230 /gene=rhsACDS 1.4230 /note=similar to ECs4470 of Escherichia coli O157:H7 str. Sakai /codon_start=1 /transl_table=11 /product=RhsA /protein_id=ACS32247.1GI:239877792 /translation=MSGKPAARQGDMTQYGGSIVQGSAGVRIGAPTGVACSVCPGGVT SGHPVNPLLGAKVLPGETDIALPGPLPFILSRTYSSYRTKTPAPVGSLGPGWKMPAD

5、I RLQLRDNTLILSDNGGRSLYFEHLFPGEDGYSRSESLWLVRGGVAKLDEGHRLAALWQ ALPEELRLSPHRYLATNSPQGPWWLLGWCERVPEADEVLPAPLPPYRVLTGLVDRFGR TQTFHREAAGEFSGEITGVTDGAGRHFRLVLTTQAQRAEEARQQAISGGTEPSAFPDT LPGYTEYGRDNGIRLSAVWLTHDPEYPENLPAAPLVRYGWTPRGELAVVYDRSGKQVR SFTYDDKYRGRMVAHRHTGRPEIRYRYDSDGRVTEQLNPAGLSYTYQYEKDRITITDS LNR

6、REVLHTQGEGGLKRVVKKEHADGSVTQSQFDAVGRLRAQTDAAGRTTEYSPDVVT GLITRITTPDGRASAFYYNHHSQLTSATGPDGLEIRREYDEWGRLIQETAPDGDITRY RYDNPHSDLPCATEDATGSRKTMTWSRYGQLLSFTDCSGYVTRYDHDRFGQMTAVHRE EGLSQYRAYDSRGQLIAVKDTQGHETRYEYNAAGDLTTVIAPDGSRNGTQYDAWGKAI CTTQGGLTRSMEYDAAGRVIRLTSENGSHTTFRYDVLDRLIQETGFDGRTQRYHHDLT GKLIRSED

7、EGLVTHWHYDEADRLTHRTVKGETAERWQYDERGWLTDISHISEGHRVTV HYGYDEKGRLTGERQTVHHPQTEALLWQHETRHAYNAQGLANRCIPDSLPAVEWLTYG SGWLAGMKLGDTPLVDFTRDRLHRKTLRRFGRYELTTAYTPAGQLQSQHLNSLQYDRD YTWNDNGELIRISSPRQTRSYSYSDSGRLTGVHTTAANLDIRIPYATDPAGNRLPDPE LHPDSTLSMWPDNRIARDAHYLYWYDRHGRLTEKTDLIPEGVIRTDDERTHRYHYDSQ HRLVHYTRTQYEE

8、PLVESRYLYDPLGRRVAKRVWRRERDLTGWMSLSRKPQVTWYGWD GDRLTTIQNDRTRIQTIYQPGSFTPLIRVETATGELAKTQRRSLADALQQSGGEDGGS VVFPPVLVQMLDRLESEILADRVSEESRRWLASCGLTVAQMQSQMDPVYTPARKIHLY HCDHRGLPLALISAEGATEWCAEYDEWGNLLNEENPHQLQQLIRLPGQQYDEESGLYY NRHRYYDPLHGRYITQDPIGLKGGWNFYQYPLNPVINVDPQGLVDINLYPESDLIHSV ADEINIPGVFTIGGHGTP

9、TSIESATRSIMTAKDLAYLIKFDGNYKDGMTVWLFSCNTG KGQNSFASQLAKELHTNVIGPDTLWTWWGRGTNGKLKMDTVLTAPTNLNSNKDLMAIT TKDLGNWITYGPSGHPISNMQGTPEKPSDIRORIGIN 起始密码子 1 atgagcggaaaaccggcggcgcgtcagggcgacatgacgcagtatggcggtagcattgtt 61 cagggttcagccggggtgcgcattggtgcccccaccggcgtggcctgttcggtgtgcccc 121 ggcggagtgacgtccggccatccgg

10、tcaatcccctgctcggtgcaaaggtccttcccggt 181 gaaaccgacatcgccctgcccggcccgctgccgttcatcctctcccgcacctacagcagt 241 taccggacaaaaacgcccgcgccggtggggagcctcggccccggctggaaaatgcctgcg 301 gatatccgcttacagctgcgcgataacacactgatactcagtgataacggcggcagaagc 361 ctgtattttgagcacctgtttcccggtgaggacggttacagccgcagcgagtcactctgg 421

11、ctggtgcgcggcggcgtggcgaaactggatgaaggtcaccggctggccgcactctggcag 481 gcgctgccggaagaactccgcttaagtccgcatcgttatctggcgacaaacagtccgcag 541 gggccgtggtggctgctcggctggtgtgagcgggtgccggaagcggatgaggtgctgcct 601 gcgccgctgccgccgtaccgggtactgaccgggctggtggaccgcttcgggcgcacacag 661 acgttccaccgcgaagccgccggtgaattcagcggcgaaa

12、tcaccggcgtgacggatggt 721 gccgggcgtcacttccggctggtactgaccacgcaggcgcagcgggcagaagaagcccgg 781 cagcaggccatttccggcgggacggaaccgtccgcttttcctgataccctgccgggttac 841 accgaatatggccgggacaacggcatccgtctgtctgccgtgtggctgacgcacgacccg 901 gaatacccggagaatttacctgccgcgccgctggtgcgctatggctggacgccgcgcggc 961 gaactggcggtggtg

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15、taccgttatgataatccacacagtgacttaccctgcgca 1561 acggaagatgccaccggcagccggaaaaccatgacgtggagccgttacggtcagttgctg 1621 agcttcaccgactgttccggttatgtaacccgttatgaccatgaccgcttcgggcagatg 1681 acggcggtgcaccgcgaggaagggctgagtcagtaccgcgcatacgacagccgtggacag 1741 ttaattgccgtgaaagacacgcagggccatgaaacgcggtatgaatacaacgccgcc

16、ggt 1801 gacctgaccaccgtcattgccccggacggcagcagaaacgggacacagtacgatgcgtgg 1861 ggaaaagccatctgtaccacgcagggcggtctgacgcgcagtatggaatacgatgctgcc 1921 ggacgggtcatccgcctgaccagtgaaaacggcagccacaccaccttccgttacgatgta 1981 ctcgaccggctgatacaggaaaccggctttgacggccgcacacagcgttatcaccacgac 2041 ctgaccggcaaacttatccgcagcgag

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19、cgccagacccggagttacagctacagc 2641 gactccggcaggctgaccggcgttcacaccaccgcagcgaatctggatatccgcatcccg 2701 tatgccacggacccggcaggtaaccgcctgcccgacccggagctgcacccggacagcacc 2761 ctcagcatgtggccggataaccgtatcgcccgtgacgcgcactatctttactggtatgac 2821 cgtcacggcaggctgacagagaaaaccgacctcatcccggaaggggttatccgcacggat 2881 gat

20、gagcggactcaccggtaccattacgacagtcagcaccggctggtgcactacacgcgg 2941 acacaatatgaagagccgctggtcgaaagccgctatctttacgacccgctgggccgcagg 3001 gtggcaaaacgggtgtggcgacgtgaacgggacctgacgggctggatgtcgctgtcacgg 3061 aaaccgcaagtgacctggtacggctgggacggcgaccggctgaccacaatacagaacgac 3121 agaacccgcatccagacgatttatcagccggggagcttc

21、acgccactcatcagggttgaa 3181 accgccaccggtgagctggcgaaaacgcagcgccgcagcctggcggatgcgcttcagcag 3241 tccggcggcgaagacggtggcagtgtggtgttcccgccggtgctggtgcagatgctcgac 3301 cggctggaaagtgaaatcctggctgaccgggtgagtgaggaaagccgccgctggctggca 3361 tcgtgcggcctgactgtggcgcagatgcaaagccagatggacccggtatacacgccggcg 3421 cgaaaaatc

22、cacctgtaccactgcgaccatcgcggcctgccgctggcgcttatcagtgcg 3481 gaaggggcaacagaatggtgcgcagaatacgatgaatggggcaacctgctgaatgaagag 3541 aacccgcatcagctgcagcagcttatccgcctgccggggcagcagtatgatgaggagtcc 3601 ggcctgtattacaaccgccaccgctattatgacccgctgcacgggcgatatatcactcag 3661 gatccgattggactgaaggggggatggaatttttatcagtatccg

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24、tttgctagccaattagctaaagagttacatacaaatgtaatagga 4021 cctgacacgctatggacgtggtgggggcgaggaactaatggtaagttaaaaatggataca 4081 gtgctaacagcaccaacgaaccttaattcaaataaggatctaatggctataacaacaaaa 4141 gaccttggtaattggataacatatgggccatctgggcaccccatttctaatatgcaaggt 4201 acgccagaaaaacccagtgatataagatag/终止密码子2、表达载体的选择出品公司:I

25、nvitrogen载体名称:pPIC9K, pPIC 9K质粒类型:毕赤酵母蛋白表达载体表达水平:高拷贝启动子:AOX1克隆方法:多克隆位点，限制性内切酶载体大小:9276 bp5 测序引物及序列:5 AOX1:-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3；alpha-Factor-F: 5-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-333-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3载体标签:N-alpha factor载体抗性:氨苄和卡那筛选标记:HIS4备注:利用alpha分泌因子，分泌表达蛋白。产品目录号:V175-20稳定性:稳定 Stable组成型:组成型 Constitu

26、tive病毒/非病毒:非病毒pPIC9K载体详细信息如下： pPIC9载体大小9276 bp，是融合表达载体。载体构建过程中，可供使用的单一限制性内切酶位点为SnaB I, EcoR I, Avr II, Not I.利用alpha因子分泌信号肽，分泌表达蛋白基因。在载体构建过程中，你的基因必须保证与信号肽的起始密码子的读码框一致。毕赤酵母中利用HIS4进行筛选。为了将基因插入GS115或KM71的AOX区, 使用SacI限制性内切酶线性化质粒（GS115中产生His+Mut+基因型，KM71中产生His+ MutS基因型）为了将基因插入GS115或KM71的His4区, 使用Sal I或者S

27、tu I限制性内切酶线性化质粒（GS115中产生His+ Mut+基因型，KM71中产生His+ MutS基因型）将基因插入GS115的AOX1区域，需要使用Bgl II线性化质粒 （产生His+MutS基因型）。载体序列3、宿主细胞的选择巴斯德毕赤酵母表达体系是近十年发展起来的真核表达体系。作为一种成功的表达体系，有好几种因素促进了它的快速推广。主要包括如下几方面：（1）利用受甲醇诱导的醇氧化酶（alcohol oxidase I，AOX1）启动子，可严格控制外源基因的表达。（2）毕赤酵母属于单细胞微生物，保留了细菌的特点，营养要求简单，生长快速，适合高密度培养，发酵后每升培养液中细胞干重可

28、达100克以上，有利于提高目的蛋白产量；发酵技术也比较成熟，具有大规模生产基因工程产品的潜力。（3）酵母是低等真核生物，很少产生有毒物质，毒性比细菌小。（4）毕赤酵母作为一种真核细胞生物，具有真核生物的亚细胞结构，可进行很多典型的高等真核生物的蛋白翻译后加工修饰，如糖基化、脂酞化、磷酸化以及蛋白裂解、折叠、二硫键的形成等。（5） 毕赤酵母分子生物学操作技术与酿酒酵母非常相似，而后者的遗传背景和生理特性研究得比较透彻，是现代生物学中了解较清楚、应用很广泛的表达系统之一，因而可为前者提供很多借鉴；另外，毕赤酵母也已有20多年的研究开发历史，有多种受体菌和表达载体可供选择，可以进行胞内表达或分泌表达

29、。（6）产物易于纯化，特别是高分泌性的外源蛋白占所有被分泌蛋白的30%以上，容易分离。4、引物设计： PCR引物设计原理：PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。 PCR引物设计原则：1.引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。SnaBI: 5. TA CGTA.3. ATGCAT.5AvrII 5. CCTAGG.3 3. GGATCC.5SacL:. GAGCT