基因组大作业文档格式.docx
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Goto:
LOCUSFJ8397274230bpDNAlinearBCT14-SEP-2009
DEFINITIONEscherichiacolistrainNE037RhsA（rhsA）gene,completecds.
ACCESSIONFJ839727
VERSIONFJ839727.1GI:
239877791
KEYWORDS.
SOURCEEscherichiacoli
ORGANISMEscherichiacoli
Bacteria;
Proteobacteria;
Gammaproteobacteria;
Enterobacteriales;
Enterobacteriaceae;
Escherichia.
REFERENCE1（bases1to4230）
AUTHORSLiu,K.,Knabel,S.J.andDudley,E.G.
TITLErhsgenesarepotentialmarkersformultilocussequencetypingof
EscherichiacoliO157:
H7strains
JOURNALAppl.Environ.Microbiol.75（18）,5853-5862（2009）
PUBMED19633111
REFERENCE2（bases1to4230）
TITLEDirectSubmission
JOURNALSubmitted（18-MAR-2009）FoodScience,ThePennsylvaniaState
University,326FoodScienceBuilding,UniversityPark,PA16802,
USA
FEATURESLocation/Qualifiers
source1..4230
/organism="
Escherichiacoli"
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genomicDNA"
/strain="
NE037"
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taxon:
562"
gene1..4230
/gene="
rhsA"
CDS1..4230
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similartoECs4470ofEscherichiacoliO157:
H7str.
Sakai"
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RhsA"
/protein_id="
ACS32247.1"
GI:
239877792"
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ALPEELRLSPHRYLATNSPQGPWWLLGWCERVPEADEVLPAPLPPYRVLTGLVDRFGR
TQTFHREAAGEFSGEITGVTDGAGRHFRLVLTTQAQRAEEARQQAISGGTEPSAFPDT
LPGYTEYGRDNGIRLSAVWLTHDPEYPENLPAAPLVRYGWTPRGELAVVYDRSGKQVR
SFTYDDKYRGRMVAHRHTGRPEIRYRYDSDGRVTEQLNPAGLSYTYQYEKDRITITDS
LNRREVLHTQGEGGLKRVVKKEHADGSVTQSQFDAVGRLRAQTDAAGRTTEYSPDVVT
GLITRITTPDGRASAFYYNHHSQLTSATGPDGLEIRREYDEWGRLIQETAPDGDITRY
RYDNPHSDLPCATEDATGSRKTMTWSRYGQLLSFTDCSGYVTRYDHDRFGQMTAVHRE
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CTTQGGLTRSMEYDAAGRVIRLTSENGSHTTFRYDVLDRLIQETGFDGRTQRYHHDLT
GKLIRSEDEGLVTHWHYDEADRLTHRTVKGETAERWQYDERGWLTDISHISEGHRVTV
HYGYDEKGRLTGERQTVHHPQTEALLWQHETRHAYNAQGLANRCIPDSLPAVEWLTYG
SGWLAGMKLGDTPLVDFTRDRLHRKTLRRFGRYELTTAYTPAGQLQSQHLNSLQYDRD
YTWNDNGELIRISSPRQTRSYSYSDSGRLTGVHTTAANLDIRIPYATDPAGNRLPDPE
LHPDSTLSMWPDNRIARDAHYLYWYDRHGRLTEKTDLIPEGVIRTDDERTHRYHYDSQ
HRLVHYTRTQYEEPLVESRYLYDPLGRRVAKRVWRRERDLTGWMSLSRKPQVTWYGWD
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ADEINIPGVFTIGGHGTPTSIESATRSIMTAKDLAYLIKFDGNYKDGMTVWLFSCNTG
KGQNSFASQLAKELHTNVIGPDTLWTWWGRGTNGKLKMDTVLTAPTNLNSNKDLMAIT
TKDLGNWITYGPSGHPISNMQGTPEKPSDIR"
ORIGIN
起始密码子
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4141gaccttggtaattggataacatatgggccatctgggcaccccatttctaatatgcaaggt
4201acgccagaaaaacccagtgatataagatag
//
终止密码子
2、表达载体的选择
出品公司:
Invitrogen
载体名称:
pPIC9K,pPIC9K
质粒类型:
毕赤酵母蛋白表达载体
表达水平:
高拷贝
启动子:
AOX1
克隆方法:
多克隆位点，限制性内切酶
载体大小:
9276bp
5'
测序引物及序列:
5´
AOX1:
-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3´
；
alpha-Factor-F:
5´
-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3´
3'
3´
-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3´
载体标签:
N-alphafactor
载体抗性:
氨苄和卡那
筛选标记:
HIS4
备注:
利用alpha分泌因子，分泌表达蛋白。
产品目录号:
V175-20
稳定性:
稳定Stable
组成型:
组成型Constitutive
病毒/非病毒:
非病毒
pPIC9K载体详细信息如下：
•pPIC9载体大小9276bp，是融合表达载体。
•载体构建过程中，可供使用的单一限制性内切酶位点为SnaBI,EcoRI,AvrII,NotI.
•利用alpha因子分泌信号肽，分泌表达蛋白基因。
•在载体构建过程中，你的基因必须保证与信号肽的起始密码子的读码框一致。
•毕赤酵母中利用HIS4进行筛选。
•为了将基因插入GS115或KM71的AOX区,使用SacI限制性内切酶线性化质粒（GS115中产生His+Mut+基因型，KM71中产生His+MutS基因型）
•为了将基因插入GS115或KM71的His4区,使用SalI或者StuI限制性内切酶线性化质粒（GS115中产生His+Mut+基因型，KM71中产生His+MutS基因型）
•将基因插入GS115的AOX1区域，需要使用BglII线性化质粒（产生His+MutS基因型）。
载体序列
3、宿主细胞的选择
巴斯德毕赤酵母表达体系是近十年发展起来的真核表达体系。
作为一种成功的表达体系，有好几种因素促进了它的快速推广。
主要包括如下几方面：
（1）利用受甲醇诱导的醇氧化酶（alcoholoxidaseI，AOX1）启动子，可严格控制外源基因的表达。
（2）毕赤酵母属于单细胞微生物，保留了细菌的特点，营养要求简单，生长快速，适合高密度培养，发酵后每升培养液中细胞干重可达100克以上，有利于提高目的蛋白产量；
发酵技术也比较成熟，具有大规模生产基因工程产品的潜力。
（3）酵母是低等真核生物，很少产生有毒物质，毒性比细菌小。
（4）毕赤酵母作为一种真核细胞生物，具有真核生物的亚细胞结构，可进行很多典型的高等真核生物的蛋白翻译后加工修饰，如糖基化、脂酞化、磷酸化以及蛋白裂解、折叠、二硫键的形成等。
（5）毕赤酵母分子生物学操作技术与酿酒酵母非常相似，而后者的遗传背景和生理特性研究得比较透彻，是现代生物学中了解较清楚、应用很广泛的表达系统之一，因而可为前者提供很多借鉴；
另外，毕赤酵母也已有20多年的研究开发历史，有多种受体菌和表达载体可供选择，可以进行胞内表达或分泌表达。
（6）产物易于纯化，特别是高分泌性的外源蛋白占所有被分泌蛋白的30%以上，容易分离。
4、引物设计：
PCR引物设计原理：
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
PCR引物设计原则：
1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
SnaBI:
5'
...T↓ACGTA...3'
...ATGCA↑T...5'
AvrII5'
...CCTAG↓G...3'
3'
...G↑GATCC...5'
SacL:
...GAGCT↓
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