脉冲场凝胶电泳Word文档格式.docx

1、5IBI FIJI 600 HV 程序性开关设备。6 缓冲液冷却循环器 （Fotodyne ， New Britain ，WI 或Mini Chiller（Bio-Rad Laboratory 。【实验步骤】1. 脉冲电场凝胶电泳的DNA 样品的制备为避免大分子DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌（StapHylococcusaureus 作为例子。1 取100mL 对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4，5000g 离心5min 。2 用20mL TEN 缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5min 。之后用10mL EC 缓冲液使细胞悬浮。3

2、取1.5mL 细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque 琼脂糖的EC缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50。4 对于每一个菌株，需要1520 个凝胶块，将它们放至含有3045g/mL RNase（50mL 的10mg/mL 的RNase 的10mL EC缓冲液中，于37振摇过夜。5 去掉裂解缓冲液，换为10mL ESP 缓冲液于50轻度振摇温育48h 。6 将凝胶块放在10mL 含有174g/mL 苯甲基磺酰氟（PMSF的TE 缓冲液中，室温温育4h（2h 换液一次 ，以灭活ESP 中的蛋白酶K 。7 用TE 清洗琼脂块6h（2h 换液一次

3、，置于TE 中4保存。2. 限制酶消化提高PFGE 的分辨率取决于1001000kb 片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。（生物秀实验频道125L10 反应缓冲液，30U 限制酶，加双蒸水至250L 混匀。2 取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜（按内切酶要求 后，用TE 缓冲液洗涤并贮存。3. 应用PFGE 对样品DNA 进行分析1 用0.5TBE 缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT 琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用Wide Minisub Cell进行电泳的话，50mL 该溶液即可。2 胶凝后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀

4、切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。（若样品在溶液中，以l:1的比率与 502%Seaplaque 琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中 。3 把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14冷却。4 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速（510mL/rain或打开变速泵至40。5 通过计算机启动极性转换程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为3.5h 或更长。小于50kb的限制性片段在0.4s 正向和0.2s 反向的电脉冲（比率为2:1下得以分离，时间为35h 。

5、6 在 0.5g/mL 溴化乙锭中进行染色并拍照。4. 分离、纯化大的DNA 片段1 凝胶染色、分析后，在目的带前（靠近正极处 切一个 0.25cm2左右的槽，注入0.8%Seaplaque琼脂糖，使之凝固。2 重新打开极性转换开关，用紫外递质检测DNA 的迁移，当目的带进入Seaplaque 凝胶中时，关闭开关，切下目的带，移至1.5mL EP 管中。3 加入2L 的tRNA ，30L 5mol/L NaCl，370L 蒸馏水，在6570之间，化胶并保温10min 。4 苯酚/氯仿500L 抽提两次。5 用2.5 倍体积95%乙醇和1/10 体积NaAc（3mol/L，pH5.2 于-701

6、0min 沉淀水相。再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE缓冲液中。【注意事项】1. 换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。2.PMSF 是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂，即有毒又挥发，操作时应在通风橱中进行。3. 用蛋白酶K 包埋的材料时50温育时间很长（2448h ，有些学者提出如此长时间不必要（Mortimer etal.1990 ，且可能造成高分子质量DNA 降解。在实验中可视情况而定。4. 琼脂糖凝胶块在TE（pH7.6中4可存放数年，如在0.5mol/L EDTA 中可存放更长时间。5. 一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源设计时均带有保护电路，它可以检测到负载的突然降低并

7、且引发外加电源自动关闭。6. 由于电压较高，就会产生热量，为了保证温度为14，需要一些冷却设备（缓冲液冷却循环器或MiniChiller 。此外，把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温。PFGE （脉冲场凝胶电泳）标准操作规程（SOP目的：运用PFGE 方法对20Kb 至数Mb 的DNA 进行分子分型背景知识：这个试验是公认的操作繁琐，至少要2天，而且每一步操作对结果的好坏都有很大影响，因此，一个严格、标准的操作方法是十分十分必要的。主体内容：一、胶块的制备1、在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml 细胞悬浊液（CSB；2、在1.5ml eppendorf管上

8、标记好对应样品的名称；3、在模具上标记好对应样品的名称；4、用CSB 湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB 中，用bioMerieux Vitek colorimeter 测其OD 值，并调整至3.64.5。如果OD 值大于4.5，加入CSB 稀释；如果OD 值小于3.6，增加菌量提高其浓度。5、取400l细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。6、从水浴箱中取出eppendorf 管，每管加入20l蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。7、制备好1

9、%Seakem Gold：1%SDS，放于56水浴箱中。8、在eppendorf 管中加入400l的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。注意事项：（1用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。（2细胞悬浊液、蛋白酶K 要置于冰上。（3在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。（4混合物加入模具时不能产生气泡。（5在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56水浴箱中。二、细胞的裂解1、在50ml 的screw-cap

10、tube上做好标记。2、配制细胞裂解液（CLB：每5ml 细胞裂解液加入25l蛋白酶 K（20mg/ml，使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。注意：蛋白酶K 要置于冰上，配制好的细胞CLB 也要置于冰上。3、每个管子加入5ml 蛋白酶K/CLB混合液。4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。（1可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap 管中。（2一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap 管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。5、保证胶块在液面下而不在管壁上。6、将管子放在54水浴摇床中孵育2小时，

11、转速约170转/分钟。7、将纯水和TE 放在50水浴摇床中预热。三、洗胶块1、从水浴摇床中拿出screw-cap 管，盖上绿色的screened-cap 。轻轻倒掉CLB 。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。2、每管中加入15ml 预热的纯水。3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50水浴摇床中，摇10分钟。4、倒掉水，用纯水再洗一次。、5、倒掉水，加入15ml 预热的TE ，在50的水浴摇床中摇15分钟。6、倒掉TE ，用TE 重复洗三次，每次1015分钟。7、倒掉TE ，加入10ml TE，放在4冰箱保存备用。要确保胶

12、块在液面下而不在管壁或盖子上。四、胶块内DNA 的酶切1、在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。2、按照下面的比例配制缓冲液H 的稀释液，混匀。试剂l/胶块l /10胶块纯水180l1800lBuffer D20l200l总体积200l2000l缓冲液要置于冰上。3、在每个1.5ml eppendorf管中加入200l缓冲液H 的稀释液。4、小心从TE 中取出胶块放在干净的培养皿上。5、用刀片切下2mm 宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE 中。6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。7、将管子放在

13、37水浴中孵育10-15分钟。8、在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。纯水175l1750l酶（10U/l5l50l（1将酶置于冰上，用后立即放在20保存。（2用枪头吸出缓冲液H ，避免损伤胶块。9、每管加入200l混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。10、在37水浴中孵育至少2小时。五、加样（一 将胶块直接粘在梳子齿上1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。2、从37水浴中取出胶块，平衡到室温。3、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。4、每管加入200l 0.5TBE 。5、把梳子平放在胶槽上，把胶块加

14、在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。6、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。7、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml 熔化的在5560平衡的1SKG 。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。8、记录加样顺序。（二 将胶块直接加在加样孔内1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。用水平仪调整胶槽使其水平。2、把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml 熔化的在5560平衡的1SKG 。3、小心拔出梳子。4、从37水浴中取

15、出胶块，平衡到室温。5、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。6、每块胶加入200l 0.5TBE 平衡。7、用小铲将胶块加入加样孔。8、用溶化的胶封闭加样孔。a 可以在加样孔中加入0.5TBE ，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽量避免气泡形成。 b 记录加样顺序。六、电泳1、确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。不要触碰电极。2、加入2.2L 0.5TBE, 关上盖子。3、打开主机和泵的开关，确保泵设在70（这时缓冲液的流速约1L/分钟和缓冲液在管道中正常循环。4、打开冷凝机，确保预设温度在14（缓冲液达到该温度通常需要20分钟左右 。5、打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用

16、吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。6、设置电泳参数。7、记录电泳初始电流（通常120145ma 。8、结束电泳：关机顺序为：冷凝机泵主机。七、图像的获取1、取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml，1：10,000稀释，即在400ml 水中加入40l储存液 。EB 是致畸剂。储存在棕色瓶中的EB 稀释液可以用3-5次。废弃的EB 溶液应妥善处理。2、将托盘放在摇床上摇25-30分钟。3、放掉电泳槽中的TBE ，用1-2L 纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。4、戴上手套将用后的EB 溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加入400-5

17、00ml 纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如果可能每20-30分钟换一次纯水。5、用Gel Doc 2000拍摄图像。如果背景干扰分析，可进一步脱色30-60分钟。6、转换成*.1sc文件用于处理分析。八、数据的分析图像的读取电泳图像通常用BIO-RAD 的GEL DOC 2000或其它成像系统来获取。其它可以替代的成像设备，只要具有CCD 相机，可以提供IBM 兼容的未压缩的TIFF 图像，且分辨力768 x 640像素，能够用BioNumerics software （Applied Maths, Inc.软件与PulseNet 数据库中其它图像进行对比分析，也可以运用。运用GEL D

18、OC 2000的简单说明：QUANTITY ONE软件1、点击QUANTITY ONE按钮打开该软件。2、点击菜单FILE GEL DOC。需要1020秒打开窗口。3、打开抽屉，把胶放在台板上。胶已经经过EB 或GEL-STAR 染色并经过充分脱色。用黑色胶框把胶放在合适的位置。关上抽屉门。图像的获取1、按下EPI-LIGHT 按钮打开白光。2、把胶放在调准网格线内，使胶的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对齐。3、保证调准网格线和过饱和按钮被选中。4、改变镜头的MIDDLE RING以调整图像的大（顺时针 小（逆时针 ，使图像占据整个窗口。如果需要，挪动胶在台板上的位置。胶的加样孔、下边界和

19、左右边界在屏幕上都应该可以看到。5、如果需要，按BOTTOM RING以调整相机的焦距。焦距的调整只可以偶尔用之，不可用于每一块胶。可以用尺子帮助调整焦距。6、按下EPI-LIGHT 关掉白光，按下UV 按钮打开透射紫外光。7、点击AUTO EXPOSE以确定大概的曝光时间。当图像出现在窗口时，AUTO EXPOSE自动关闭而MANUAL EXPOSE被激活。8、点击MANUAL EXPOSE 的按钮，调整曝光时间。而调整饱和度时，点击箭头或TURN THE TOP RING以降低光量（如果图像过饱和，图像显现红色 。如果出现对话框“曝光可以在0.03360秒之间波动”，则需通过改变相机的像素

20、以调整饱和度。调整饱和度使样品条带没有红色很重要，因为这会影响BIONUMERICS 软件对胶图像的分析。而胶加样孔的过饱和属于正常现象。9、当图像调整的比较满意时，按下FREEZE 按钮停止曝光过程。按下UV 按钮关掉紫外光（如果开门时UV 灯打开，它会自动关闭 。图像的输出1、保存图像（*.1sc：FILE SAVE 。确保选择正确的路径。文件默认的名字包括日期、时间和用户。可以改变文件名。2、打印文件：FILE PRINT VIDEO PRINT，也可以直接点击屏幕上的PRINT 按钮。3、转为*.TIFF格式：FILE EXPORT TO TIFF IMAGEEXPORT ，选择正确的

21、路径。4、关闭QUANTITY ONE程序：FILE EXIT 。5、取出胶放在染色盒内。用软麻布擦掉台板表面多余的液体，用水或70的异丙醇洗干净。 试剂储存液的配制1、121.1 g Tris base溶于650-700 ml纯水中，加入80 ml 6 N HCl*，在室温下调pH 至8.0，加水终体积至1000 ml，高压灭菌。或者157.6 g Tris-HCl 溶于800 ml 纯水中，在室温下调pH 至8.0，加水终体积至1000 ml ，高压灭菌。2、10 N NaOH*400 g NaOH小心溶于800 ml纯水中，冷却到室温，加灭菌的纯水使终体积至1000 ml。 3、0.5

22、M EDTA, pH 8.0*溶于800 ml纯水中，加入50ml 10N NaOH调pH 至8.0，加水终体积至1000 ml，分成数份，高压灭菌。4、20% Sodium Dodecyl Sulfate （SDS*十二烷基硫酸钠用于E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, PFGE将20克SDS 小心加入装有80 ml灭菌纯水的容器中，在35- 45轻轻混匀溶解，定容至100ml 。5、20 mg/ml 蛋白酶K 储存液*100 mg Proteinase K 粉末溶于5 ml 灭菌纯水中，混匀，分装在1.5 ml离心管中，每管500

23、-600 l ，-20保存备用。6、10X Tris-0.9 M Tris base （108 g0.9 M Boric Acid （55 g0.02 M EDTA, pH 8.0 （40 ml 0.5 M溶于1000 ml灭菌的纯水中，高压灭菌如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。7、Ethidium Bromide（EB*10 mg/ml EB的储存液用纯水1:10,000 稀释（即100 ml水中加入10 l 储存液 ，（500ml水中加50ul 。稀释液在丢弃前可以染5-6块胶。实验试剂用灭菌的玻璃制品、塑料制品和纯水来制备以下试剂。1、Tris:EDTA Buffer （TE, pH 8.0

24、*（10 mM Tris-HCL:1 mM EDTA , pH 8.010 ml 1 M Tris-HCL, pH 8.02 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0用灭菌的纯水稀释到1000 ml在E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, and Campylobacter jejuni PFGE 用TE Buffer 于:. 溶解1% SeaKem Gold:1% SDS agarose. 细菌裂解后洗胶块在L. monocytogenes PFGE 用TE Buffer于:. 悬浮菌细胞2、Cell Suspension Buff

25、er （CS100 mM Tris-HCl:100 mM EDTA, pH 8.0用于E. coli O157:H7, Salmonella, and Shigella sonnei PFGE10 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.020 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0用灭菌的纯水稀释到100 ml3、Cell Lysis Buffer（CLB50 mM Tris-HCl:50 mM EDTA, pH 8.0 + 1% N-Lauroyl-Sarcosine,Sodium salt （Sarcosyl，0.1mg/ml Proteinase K （用前再加入用于裂解E.

26、coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei,和 Campylobacter jejuni 25 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.050 ml 0.5 M EDTA, pH 8.050 ml 10% Sarcosyl 3用灭菌的纯水稀释到500 ml，每5 ml CLB加入25l 蛋白酶K 储存液（20 mg/ml，使其终浓度为0.1 mg/ml.5、0.5X TBE Buffer200 ml 5X TBE用纯水稀释到2000 ml或100 ml 10X TBE用纯水稀释到2000 ml用来稀释5X TBE、10X TBE的纯水可以不灭菌。6、

27、SeaKem Gold Agarose做胶块； 电泳胶报价 seakem gold 琼脂糖 25g 货号50111，1567元人民币。可打9折。125g 货号 50150 ，BMA ， 6422元。7、无菌的超纯水8、蛋白酶K 粉末或蛋白酶K 溶液（20mg/ml6、限制性内切酶E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonneiXbaI, ，AvrII （同切限制内切酶BlnI ，SpeI（NotI可用于S. sonnei；但不用于E. coli O157:H7L. monocytogenes，AscI, ApaICampylobacter jejuni, C. coli，SmaI, KpnI器 材1、Dade Microscan Turbidity MeterSpectrophotometerbioMrieux Vi