脉冲场凝胶电泳Word文档格式.docx
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5IBIFIJI600HV程序性开关设备。
6缓冲液冷却循环器(Fotodyne,NewBritain,WI或MiniChiller(Bio-RadLaboratory。
【实验步骤】
1.脉冲电场凝胶电泳的DNA样品的制备
为避免大分子DNA在提取过程中断裂,细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解,在本实验中,我们使用金黄色葡萄球菌(StapHylococcus
aureus作为例子。
1取100mL对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4℃,5000g离心5min。
2用20mLTEN缓冲液冲洗沉淀,同样条件离心5min。
之后用10mLEC缓冲液使细胞悬浮。
3取1.5mL细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque琼脂糖的EC
缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4℃凝固,混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50℃。
4对于每一个菌株,需要15~20个凝胶块,将它们放至含有30~45μg/mLRNase(50mL的10mg/mL的
RNase的10mLEC
缓冲液中,于37℃振摇过夜。
5去掉裂解缓冲液,换为10mLESP缓冲液于50℃轻度振摇温育48h。
6将凝胶块放在10mL含有174μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF的TE缓冲液中,室温温育4h(2h换液一次,以灭活ESP中的蛋白酶K。
7用TE清洗琼脂块6h(2h换液一次,置于TE中4℃保存。
2.限制酶消化
提高PFGE的分辨率取决于100~1000kb片段电泳结果的重复率,它与酶切关系密切,可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。
(生物秀实验频道
125μL10×
反应缓冲液,30U限制酶,加双蒸水至250μL混匀。
2取一个凝胶块置其中,合适温度下温育过夜(按内切酶要求后,用TE缓冲液洗涤并贮存。
3.应用PFGE对样品DNA进行分析
1用0.5×
TBE缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT琼脂糖凝胶,胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。
若用WideMinisubCell
进行电泳的话,50mL该溶液即可。
2胶凝后,小心移去样品梳。
将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小,将样心地插入加样孔,避免产生气泡。
(若样品在溶液中,以l:
1
的比率与50℃2%Seaplaque琼脂糖相混合,迅速注入加样孔中。
3把胶放入电泳槽内,加缓冲液,刚好覆盖胶的表面即可,缓冲液事先14℃冷却。
4将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。
打开电源,调节蠕动泵到适当流速(5~10mL/rain或打开变速泵至40。
5通过计算机启动极性转换程序。
大于50kb的限制性片段在1.2s和0.4s正向和反向的电脉冲下得以分离,时间一般为3.5h或更长。
小于50kb
的限制性片段在0.4s正向和0.2s反向的电脉冲(比率为2:
1下得以分离,时间为3~5h。
6在0.5μg/mL溴化乙锭中进行染色并拍照。
4.分离、纯化大的DNA片段
1凝胶染色、分析后,在目的带前(靠近正极处切一个0.25cm2左右的槽,注入0.8%Seaplaque琼脂糖,使之凝固。
2重新打开极性转换开关,用紫外递质检测DNA的迁移,当目的带进入Seaplaque凝胶中时,关闭开关,切下目的带,移至1.5mLEP管中。
3加入2μL的tRNA,30μL5mol/LNaCl,370μL蒸馏水,在65~70℃之间,化胶并保
温10min。
4苯酚/氯仿500μL抽提两次。
5用2.5倍体积95%乙醇和1/10体积NaAc(3mol/L,pH5.2于-70℃10min沉淀水相。
再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE
缓冲液中。
【注意事项】
1.换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。
2.PMSF是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂,即有毒又挥发,操作时应在通风橱中进行。
3.用蛋白酶K包埋的材料时50℃温育时间很长(24~48h,有些学者提出如此长时间不必要(Mortimeret
al.1990,且可能造成高分子质量DNA降解。
在实验中可视情况而定。
4.琼脂糖凝胶块在TE(pH7.6中4℃可存放数年,如在0.5mol/LEDTA中可存放更长时间。
5.一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳,因为这些电源设计时均带有保护电路,它可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭。
6.由于电压较高,就会产生热量,为了保证温度为14℃,需要一些冷却设备(缓冲液冷却循环器或MiniChiller。
此外,把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温。
PFGE(脉冲场凝胶电泳)标准操作规程(SOP
目的:
运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型
背景知识:
这个试验是公认的操作繁琐,至少要2天,而且每一步操作对结果的好坏都有很大影响,因此,一个严格、标准的操作方法是十分十分必要的。
主体内容:
一、胶块的制备
1、在Falcon2054管上标记样品名称和空白对照,分别加入约2ml细胞悬
浊液(CSB;
2、在1.5mleppendorf管上标记好对应样品的名称;
3、在模具上标记好对应样品的名称;
4、用CSB湿润接种环,从培养皿上刮取适量细菌,均匀悬浊于CSB中,
用bioMerieuxVitekcolorimeter测其OD值,并调整至3.6~4.5。
如果OD值大于4.5,加入CSB稀释;
如果OD值小于3.6,增加菌量提高其浓度。
5、取400μl细菌悬浊液于相应的1.5mleppendorf管中,置于37℃水浴中孵
育5分钟。
将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。
6、从水浴箱中取出eppendorf管,每管加入20μl蛋白酶K(储存液浓度为
20mg/ml混匀,使其终浓度为0.5mg/ml。
7、制备好1%SeakemGold:
1%SDS,放于56℃水浴箱中。
8、在eppendorf管中加入400μl的1%SeakemGold:
1%SDS,用枪头轻轻
混匀。
9、将混合物加入模具,避免气泡产生,在室温下凝固10-15分钟。
注意事项:
(1用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。
(2细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。
(3在混合细胞悬浊液和1%SeakemGold:
1%SDS时要避免气泡的产生。
(4混合物加入模具时不能产生气泡。
(5在加1%SeakemGold:
1%SDS的过程中1%SeakemGold:
1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。
二、细胞的裂解
1、在50ml的screw-captube上做好标记。
2、配制细胞裂解液(CLB:
每5ml细胞裂解液加入25μl蛋白酶K(20mg/ml,使其终浓度为0.1mg/ml,然后颠倒混匀。
注意:
蛋白酶K要置于冰上,配制好的细胞CLB也要置于冰上。
3、每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。
4、如果想使胶块平齐,可以用刀片削去模具表面多余的部分。
(1可重复利用的模具:
打开模具,用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。
(2一次性模具:
撕掉模具下面的胶带,用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中,将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。
5、保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时,转速约170转/分钟。
7、将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块
1、从水浴摇床中拿出screw-cap管,盖上绿色的screened-cap。
轻轻倒掉
CLB。
在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。
把管倒置在吸水纸上,使管内液体被尽量排除干净。
随后的操作中也如此。
2、每管中加入15ml预热的纯水。
3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上,放回50℃水浴摇床中,摇10分钟。
4、倒掉水,用纯水再洗一次。
、
5、倒掉水,加入15ml预热的TE,在50℃的水浴摇床中摇15分钟。
6、倒掉TE,用TE重复洗三次,每次10-15分钟。
7、倒掉TE,加入10mlTE,放在4℃冰箱保存备用。
要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。
四、胶块内DNA的酶切
1、在1.5mleppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。
2、按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液,混匀。
试剂μl/胶块μl/10胶块
纯水180μl1800μl
BufferD20μl200μl
总体积200μl2000μl
缓冲液要置于冰上。
3、在每个1.5mleppendorf管中加入200μl缓冲液H的稀释液。
4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。
5、用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5mleppendorf管中。
确保胶块在液面下面。
将剩余的胶块放回原来的TE中。
6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。
7、将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。
8、在用稀释缓冲液孵育的过程中,按照以下的比例配制酶切缓冲液,混匀。
纯水175μl1750μl
酶(10U/μl5μl50μl
(1将酶置于冰上,用后立即放在-20℃保存。
(2用枪头吸出缓冲液H,避免损伤胶块。
9、每管加入200μl混合液,轻轻在实验台上磕管子的底部,确保胶块在液面的下面。
10、在37℃水浴中孵育至少2小时。
五、加样
(一将胶块直接粘在梳子齿上
1、调整梳子的高度,使梳子齿与胶槽的底面相接触。
用水平仪调整胶槽使
其水平。
2、从37℃水浴中取出胶块,平衡到室温。
3、用枪头吸出酶切混合液,避免损伤或吸出胶块。
4、每管加入200μl0.5×
TBE。
5、把梳子平放在胶槽上,把胶块加在梳子齿上。
如果用的是10个齿的梳
子,把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。
6、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体,在室温下风干约3分钟。
7、把梳子放入胶槽,确保所有的胶块在一条线上,并且胶块与胶槽的底面
相接触。
从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在55℃-60℃平衡的1%SKG。
避免气泡的生成;
如果有,用枪头消除。
在室温下凝固30分钟左右。
8、记录加样顺序。
(二将胶块直接加在加样孔内
1、调整梳子的高度,使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。
用水平仪调整胶
槽使其水平。
2、把梳子放入胶槽,从胶槽的中央缓慢倒入100ml熔化的在55℃-60℃平
衡的1%SKG。
3、小心拔出梳子。
4、从37℃水浴中取出胶块,平衡到室温。
5、用枪头吸出酶切混合液,避免损伤或吸出胶块。
6、每块胶加入200μl0.5×
TBE平衡。
7、用小铲将胶块加入加样孔。
8、用溶化的胶封闭加样孔。
a可以在加样孔中加入0.5×
TBE,利用毛细作用将胶块沉在加样孔底,尽量避免气泡形成。
b记录加样顺序。
六、电泳
1、确保电泳槽是水平的。
如果不水平,调整槽底部的旋钮。
不要触
碰电极。
2、加入2.2L0.5×
TBE,关上盖子。
3、打开主机和泵的开关,确保泵设在-70(这时缓冲液的流速约1L/分钟
和缓冲液在管道中正常循环。
4、打开冷凝机,确保预设温度在14℃(缓冲液达到该温度通常需要20分钟左右。
5、打开胶槽的旋钮,取出凝固好的胶,用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶,小心的把胶放入电泳槽,关上盖子。
6、设置电泳参数。
7、记录电泳初始电流(通常120-145ma。
8、结束电泳:
关机顺序为:
冷凝机-泵-主机。
七、图像的获取
1、取出胶,放在盛放400mlEB溶液的托盘内(EB储存液浓度为10mg/ml,
1:
10,000稀释,即在400ml水中加入40μl储存液。
EB是致畸剂。
储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用3-5次。
废弃的EB溶液应妥善处理。
2、将托盘放在摇床上摇25-30分钟。
3、放掉电泳槽中的TBE,用1-2L纯水清洗电泳槽,并倒掉液体。
4、戴上手套将用后的EB溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中,在托盘中加
入400-500ml纯水,放在摇床上脱色60-90分钟,如果可能每20-30分钟换一次纯水。
5、用GelDoc2000拍摄图像。
如果背景干扰分析,可进一步脱色30-60分钟。
6、转换成*.1sc文件用于处理分析。
八、数据的分析
图像的读取
电泳图像通常用BIO-RAD的GELDOC2000或其它成像系统来获取。
其它可以替代的成像设备,只要具有CCD相机,可以提供IBM兼容的未压缩的TIFF图像,且分辨力≥768x640像素,能够用BioNumericssoftware(AppliedMaths,Inc.软件与PulseNet数据库中其它图像进行对比分析,也可以运用。
运用GELDOC2000的简单说明:
QUANTITYONE软件
1、点击QUANTITYONE按钮打开该软件。
2、点击菜单FILE→GELDOC。
需要10-20秒打开窗口。
3、打开抽屉,把胶放在台板上。
胶已经经过EB或GEL-STAR染色并经过充分脱色。
用黑色胶框把胶放在合适的位置。
关上抽屉门。
图像的获取
1、按下EPI-LIGHT按钮打开白光。
2、把胶放在调准网格线内,使胶的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对齐。
3、保证调准网格线和过饱和按钮被选中。
4、改变镜头的MIDDLERING以调整图像的大(顺时针小(逆时针,使图像占据整个窗口。
如果需要,挪动胶在台板上的位置。
胶的加样孔、下边界和左右边界在屏幕上都应该可以看到。
5、如果需要,按BOTTOMRING以调整相机的焦距。
焦距的调整只可以偶尔用之,不可用于每一块胶。
可以用尺子帮助调整焦距。
6、按下EPI-LIGHT关掉白光,按下UV按钮打开透射紫外光。
7、点击AUTOEXPOSE以确定大概的曝光时间。
当图像出现在窗口时,AUTOEXPOSE自动关闭而MANUALEXPOSE被激活。
8、点击MANUALEXPOSE的↑↓按钮,调整曝光时间。
而调整饱和度时,点击箭头或TURNTHETOPRING以降低光量(如果图像过饱和,图像显现红色。
如果出现对话框“曝光可以在0.03-360秒之间波动”,则需通过改变相机的像素以调整饱和度。
调整饱和度使样品条带没有红色很重要,因为这会影响BIONUMERICS软件对胶图像的分析。
而胶加样孔的过饱和属于正常现象。
9、当图像调整的比较满意时,按下FREEZE按钮停止曝光过程。
按下UV按钮关掉紫外光(如果开门时UV灯打开,它会自动关闭。
图像的输出
1、保存图像(*.1sc:
FILE→SAVE。
确保选择正确的路径。
文件默认的名字包括日期、时间和用户。
可以改变文件名。
2、打印文件:
FILE→PRINT→VIDEOPRINT,也可以直接点击屏幕上的PRINT按钮。
3、转为*.TIFF格式:
FILE→EXPORTTOTIFFIMAGE→EXPORT,选择正确的路径。
4、关闭QUANTITYONE程序:
FILE→EXIT。
5、取出胶放在染色盒内。
用软麻布擦掉台板表面多余的液体,用水或70%的异丙醇洗干净。
试剂储存液的配制
1、
121.1gTrisbase溶于650-700ml纯水中,加入80ml6NHCl*,在室温下调pH至8.0,加水终体积至1000ml,高压灭菌。
或者157.6gTris-HCl溶于800ml纯水中,在室温下调pH至8.0,加水终体积至1000ml,高压灭菌。
2、10NNaOH*
400gNaOH小心溶于800ml纯水中,冷却到室温,加灭菌的纯水使终体积至1000ml。
3、0.5MEDTA,pH8.0*
溶于800ml纯水中,加入50ml10NNaOH调pH至8.0,加水终体
积至1000ml,分成数份,高压灭菌。
4、20%SodiumDodecylSulfate(SDS*十二烷基硫酸钠-用于E.coliO157:
H7,SalmonellaandShigellasonnei,PFGE
将20克SDS小心加入装有80ml灭菌纯水的容器中,在35°
-45℃轻轻混匀溶解,定容至100ml。
5、20mg/ml蛋白酶K储存液*
100mgProteinaseK粉末溶于5ml灭菌纯水中,混匀,分装在1.5ml离心管中,每管
500-600μl,-20℃保存备用。
6、10XTris-
0.9MTrisbase(108g
0.9MBoricAcid(55g
0.02MEDTA,pH8.0(40ml0.5M
溶于1000ml灭菌的纯水中,高压灭菌
如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。
7、EthidiumBromide(EB*
10mg/mlEB的储存液用纯水1:
10,000稀释(即100ml水中加入10μl储存液,(500ml水中加50ul。
稀释液在丢弃前可以染5-6块胶。
实验试剂
用灭菌的玻璃制品、塑料制品和纯水来制备以下试剂。
1、Tris:
EDTABuffer(TE,pH8.0*-(10mMTris-HCL:
1mMEDTA,pH8.0
10ml1MTris-HCL,pH8.0
2ml0.5MEDTA,pH8.0
用灭菌的纯水稀释到1000ml
在E.coliO157:
H7,SalmonellaandShigellasonnei,andCampylobacterjejuniPFGE-用TEBuffer于:
⑴.溶解1%SeaKemGold:
1%SDSagarose
⑵.细菌裂解后洗胶块
在L.monocytogenesPFGE-用TEBuffer于:
⑴.悬浮菌细胞
2、CellSuspensionBuffer(CS-100mMTris-HCl:
100mMEDTA,pH8.0
用于E.coliO157:
H7,Salmonella,andShigellasonneiPFGE
10ml1MTris-HCl,pH8.0
20ml0.5MEDTA,pH8.0
用灭菌的纯水稀释到100ml
3、CellLysisBuffer(CLB-50mMTris-HCl:
50mMEDTA,pH8.0+1%N-Lauroyl-Sarcosine,
Sodiumsalt(Sarcosyl,0.1mg/mlProteinaseK(用前再加入
用于裂解E.coliO157:
H7,Salmonella,Shigellasonnei,和Campylobacterjejuni25ml1MTris-HCl,pH8.0
50ml0.5MEDTA,pH8.0
50ml10%Sarcosyl3
用灭菌的纯水稀释到500ml,每5mlCLB加入25μl蛋白酶K储存液(20mg/ml,使其终浓度为0.1mg/ml.
5、0.5XTBEBuffer
200ml5XTBE用纯水稀释到2000ml或
100ml10XTBE用纯水稀释到2000ml
用来稀释5XTBE、10XTBE的纯水可以不灭菌。
6、SeaKemGoldAgarose
-做胶块;
-电泳胶
报价seakemgold琼脂糖25g货号50111,1567元人民币。
可打9折。
125g货号50150,BMA,6422元。
7、无菌的超纯水
8、蛋白酶K粉末或蛋白酶K溶液(20mg/ml
6、限制性内切酶
E.coliO157:
H7,Salmonella,Shigellasonnei
-XbaI,,AvrII(同切限制内切酶BlnI,SpeI
(NotI可用于S.sonnei;
但不用于E.coliO157:
H7
L.monocytogenes,-AscI,ApaI
Campylobacterjejuni,C.coli,-SmaI,KpnI
器材
1、DadeMicroscanTurbidityMeter
Spectrophotometer
bioMé
rieuxVi