山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响Word文档格式.docx

1、0.05）。结论：山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞有明显的促凋亡作用，其机制可能与上调Cyt-C、Bax、Caspase-3下调Bcl-2蛋白的表达有关。【关键词】 山慈菇提取物；结肠癌HT29细胞；凋亡 【中图分类号】R282.71 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）16-0017-03 Abstract：Objective To investigate the effects of Cremastra appendiculata extract on proliferation and apoptosis in human colon cancer HT29

2、cells.Methods Using the MTT assay to determine the cell inhibition rates on human colon cancer HT29 cells；the flow cytometry to determine the apoptosis rates；Western blot technology to determine the expressions of Cyt-C、Bcl-2、Bax and Caspase-3 protein.Results Cremastra appendiculata extract inhibite

3、d the human colon cancer HT29 cells in a time dependent and dose dependent manner. the apoptosis rates of the cells were increased after being cultured by Cremastra appendiculata extract； the expressions of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein were increased and the expression of Bcl-2 protein was decrea

4、sed（P0.05）.Conclusions Cremastra appendiculata extract can induce the apoptosis of HT29 cells by a mechanism that may be related to increase the expression of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein as well as decrease the expression of Bcl-2 protein. Keywords：Cremastra Appendiculata Extract；Human Colon Can

5、cer HT29 Cells；Apoptosis 结肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率逐年增高，随着手术、放疗、化疗等的进步，早中期结肠癌治疗效果明显提高，但对于中晚期、高龄及难手术患者缺少有效的治疗方法。目前，越来越多的医务科研工作者将目光投向天然动植物的研究，从中寻找可以防治肿瘤的有效成分，日渐成为临床抗肿瘤药物研究的热点1-2。山慈菇是常用的抗肿瘤中药之一，为兰科植物中杜鹃兰、独蒜兰及云南独蒜兰的干燥假鳞茎，具有解毒、化痰、散结等功效，临床上常以配伍用药的形式应用于各种肿瘤的治疗，其中包括结直肠癌3。现代药理研究表明，山慈菇具有抗肿瘤细胞生长、抑制血管生成、抗炎以及影响造血

6、系统等作用，但其抗肿瘤的作用机制尚未完全阐明4。研究拟探讨山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响，以期为山慈菇运用于结肠癌的治疗提供实验依据。1 仪器与材料 1.1 仪器 细胞培养箱MCO-175（日本Sanyo公司）；流式细胞仪6HT2L（美国Guava Easy Cyte公司）；BX50显微镜（日本Olympus公司）；超净工作台VD1320（哈尔滨东联技术开发有限公司）；高速冷冻离心机CR21（日本Hitachi公司）；凝胶成像仪及凝胶成像分析系统 GelDOC2000（美国Bio-Rad公司）。1.2 材料 山慈菇提取物（沈阳药科大学植物化学教研室提供，纯度为98 %。称取50g山

7、慈菇粉末先后加入500mL、400mL、300mL去离子水加热，冷却过滤，浓缩至200mL，加入95%乙醇冷藏洗涤，最后获得干粉6g，使用培养基配置成所需要的浓度）。胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；RPMI1640 培养液（Gibco生物工程有限公司）；0.5%二甲基亚砜、MTT（DMSO，美国Sigma公司）；Annexin V/PI凋亡试剂盒（南京凯基生物技术有限公司），Cyt-C抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Caspase-3抗体、-actin、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（美国Santa Cruz公司）；吸附（ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）。2

8、方法 2.1 人结肠癌细胞HT29的培养 将人结肠癌细胞株HT-29置于56、30min 10%胎牛血清、RPMI1640培养液中，于37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每23天传代一次，留取对数生长期的细胞用于实验。2.2 MTT法检测细胞抑制率 取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化并收集细胞，以RPMI1640培养液调整细胞密度至1105个/mL，接种于96孔培养板中，每孔0.1mL，在培养箱中培养24h使细胞贴壁。空白对照组加入培养基0.1mL，不同浓度的山慈菇提取物组以10、20、30mg/mL培养细胞24、48、72h后，吸弃各孔中培养液，每孔加入0.1mLMTT含 5%

9、磷酸盐缓冲液（PBS），在37下孵育4h后弃去上清，加入0.5%DMSO 0.1mL，振荡摇匀，室温放置10min。在0.1mL DMSO中发现蓝紫色的MTT甲臜沉淀物，使用ELISA法以酶标仪于490nm波长处测定OD值，计算细胞抑制率=（1-实验组OD值/空白对照组OD值）100%。2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化并收集细胞，以RPMI1640培养液调整细胞密度至1105个/mL，接种于96孔培养板中，每孔0.1mL，移入培养箱中培养24h使细胞贴壁。以0（空白对照组）、10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后，每孔悬浮细胞用PBS洗2次

10、，加入500l Binding Buffer和FITC标记的Annexin（20g/mL）10l和碘化丙啶（PI，50g/mL）5l，避光反应15min，采用流式细胞仪定量检测，计算凋亡率。2.4 Western blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达 取对数生长期细胞，用RPMI1640培养液调整细胞密度至1105个/mL，接种于6孔培养板中，每孔0.1mL，移入培养箱中培养24h使细胞贴壁。以0（空白对照组）、10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后，用裂解液抽提。根据蛋白提取试剂盒操作说明提取各组细胞总蛋白，将细胞的蛋白样品定量，变性；进行

11、聚丙烯酰胺凝胶电泳；转膜；脱脂牛奶封闭2h；洗膜，加入Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3 （稀释倍数11000）的一抗以及-actin（稀释倍数11000）作为阳性对照，4过夜；加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h，然后洗膜、风干；ECL发光显影。用凝胶图像分析系统进行数据分析。2.5 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析。计量资料以（xs）表示，多组间的比较用单因素方差分析，两组之间比较用LSD法进行统计。P0.05为差异有统计学意义。3 结果 3.1 细胞抑制率的测定 MTT结果显示，随着时间与药物干预浓度的增加，山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞生

12、长增殖的抑制率逐渐增加，差异有统计学意义（P0.01），并且抑制作用呈时间、剂量依赖关系。见表1。3.2 细胞凋亡率的测定 与空白对照组比较，10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后，细胞出现明显凋亡，并且随着山慈菇提取物浓度的增加，凋亡细胞的比例逐渐增大，差异有统计学意义（P0.01），并呈剂量依赖性。见表2。3.3 Western blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、 Caspase-3蛋白表达的测定 由图1可知，10、20、30 mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h 后，山慈菇提取物可使Cyt-C、Caspase-3、Bax蛋白表达增强，而Bcl-2蛋白表达减弱，

13、差异有统计学意义（P0.05），并呈剂量依赖关系。4 讨论 细胞凋亡是基因介导的主动发生的程序性死亡，在正常情况下细胞凋亡与增殖维持动态平衡5。细胞凋亡既可以出现在正常的生理过程中，也可以出现在多种疾病中，如肿瘤因关闭了线粒体的这一调控功能，使细胞凋亡减少出现细胞过度增殖现象6。因此肿瘤的发生不仅与细胞增殖失控相关，还与细胞凋亡密切相关7，中间牵涉很多促凋亡和抗凋亡细胞因子。随着对肿瘤细胞的凋亡和调控机制认识不断深入，选择性得抑制细胞增殖与诱导细胞凋亡是治疗恶性肿瘤的一个方向8。实验采用MTT法证明山慈菇提取物能够抑制人结肠癌HT29细胞的生长，并且抑制作用随着剂量的增加、时间的延长而增强。另

14、外在细胞培养过程中，出现了大量的细胞凋亡，通过流式细胞仪检测的HT29细胞凋亡情况，结果表明，山慈菇提取物能够促进细胞凋亡，并且具有剂量依赖性。凋亡是多基因严格控制的过程，包括Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53等。而Caspase家族的凋亡途径包括两条：死亡受体介导的外源性途径（Fas-FasL）；线粒体介导的内源性调亡途径。而Bcl-2家族成员又与线粒体介导的凋亡途径密切相关9。研究表明：细胞在外界以及DNA损伤等内部信号的刺激下将Bcl-2家族中的成员聚集在线粒体，在促凋亡与抑凋亡因子的作用下调节细胞色素C（Cyt-C）的释放，在胞浆中其与凋亡相关因子结合

15、形成多聚体，激活Caspase-9，再激活其下游的Caspase-3，细胞发生凋亡10-11。Bcl-2作为抑凋亡基因，在生长因子受体介导的信号传导途径中起作用，其通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤的发病。而Bax则与其相反，它能促进细胞凋亡12。若Bcl-2过表达，则与Bax形成异二聚体抑制细胞凋亡，若Bax过表达，则形成同源二聚体促进细胞凋亡13。另外，研究提出Bcl-2/Bax比率关系细胞凋亡，当比率增大时，细胞凋亡受到抑制14。本实验通过Western-blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、 Caspase-3在人结肠癌HT29细胞中蛋白的表达，来研究山慈菇提取物对细胞凋亡的影响。结果

16、显示，山慈菇提取物通过提高Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表达降低Bcl-2蛋白表达来诱导细胞凋亡。综上所述，山慈菇提取物可以通过调节Cyt-C、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达来抑制结肠癌HT29细胞增殖，诱导细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。但本实验处于初步探讨阶段，仍需进一步加强山慈菇的实验研究，发掘山慈菇在肿瘤治疗中的作用。参考文献 1Rasool S， Kadal SA， Rasool V， et al.A comparative overview of general risk factors associated with the incidence of

17、colorectal cancerJ.Tumour Biol，2013，34（5）： 2469-2476. 2Martin RC， Aiyer HS， Malik D， et al. Effect on pro-inflammatory and antioxidant genes and bioavailable distribution of whole turmeric vs curcumin： Similar root but different effectsJ.Food Chem Toxicol，2012，50（2），227-231. 3 范海洲.山慈菇药理研究J.湖北中医杂志，20

18、15， 37（2）：74-75. 4 董海玲，郭顺星，王春兰，等.山慈菇的化学成分和药理作用究进展J.中草药，2007，11（38）：1734-1738. 5 Hassan I H， Zhang M S， Powers Ls， et al. Influenza A viral replication is blocked by inhibition of the inositol- requiring enzyme 1（IRE1） stress pathwayJ.J Biol Chem， 2012，287（7）：4679-4689. 6 马远娜.蚯蚓活性蛋白抗结肠癌DLD-1细胞作用机制的研究

19、D.济南：山东大学，2014. 7 杜先华，黄松，冯泓瑞，等.博落回提取物血根碱对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响J.时珍国医国药，2014，25（12）：2860-2861. 8 Green DR， Galluzzi L， Kroemer G. Cell biology Metabolic control of cell deathJ.Science，2014，345（6203）：1446. 9 Martinou JC，Youle RJ. Mitochondria in Apoptosis： Bcl-2 family Members and Mitochondrial DynamicsJ. Dev

20、Cell，2011，21（1）：92-101. 10 Estaquier J， Vallette F， Vayssiere JL， et al.The mitochondrial pathways of apoptosisJ.Adv Exp Med Biol，2012，942：157-183. 11 杨金梅，张德纯，李科，等.酪酸梭菌诱导结肠癌SW-480细胞凋亡及作用机制J.第三军医大学学报，2013，35（22）： 2448-2451. 12 金子，蔡颖，张晔，等.姜黄素对人结肠癌PI3-K/Akt 和MEK/ERK信号通路的影响J.现代肿瘤学，2015，23（12）： 1629-1631. 13 Yao Q， Chen J， Lv Y， et al. The significance of expression of auto-phagy-related gene Beclin， Bcl-2 and Bax in breast cancer tissueJ.Tumour Biol，2011，32（6）： 1163-1171. 14 杜志杰，董金垚，师如意，等.青蒿琥酯联合奥沙利铂对人结肠癌细胞HCT116的作用研究J.世界中西医结合杂志，2014，9（7）：710-713.