3T3L1细胞实验操作Word下载.docx

1、560山细胞+6ml 10%FBS （12个样） 【600山 分化1.2ml增殖】12 孔板：1400 pl 细胞 +11ml 10%FBS用25ml瓶一板对一瓶装1、 准备好12孔板、24孔板各两份（两皿细胞）、DMEM、血清、25ml瓶4个、软管。2、 配 10%FBS 90ml DMEM+10ml 血清3、 第一二瓶 各6ml 10%FBS，第三四瓶 各11ml 10%FBS4、 吸弃旧培养基，力卩2ml DMEM 摇晃清洗，吸弃，500山一皿细胞胰酶消化，显微镜观察细胞 分散开来即停止消化。5、 每皿加入2ml 10%FBS，1ml枪头打圈吹散。6、 将两皿细胞集中在一个培养皿，打圈吹

2、散。7、 560山细胞分别加入一二瓶混匀，1400山细胞分别加入三四瓶混匀。8 二瓶对应加500山细胞进24孔板（加12个孔）摇晃混匀，三四瓶对应加1ml细胞进12孔板，摇晃混匀。放培养箱， 第二天进行转染。四、细胞转染 （无酶EP管、无酶小管、全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）1、 准 Opti-MEM ，灭菌水，mic （inhibitor ），NC，Lipo3000，无酶 EP 管、无酶小管，96孔枪头板，12孔板、24孔板各2板（工具照紫外）2、 NC、mic （inhibitor ） 4 C 1500r 1.5min 离心3、 分装Lipo3000 tube 管150讪一管（

3、轻混），mic （inhibitor ）、 NC小管（换枪头加灭菌水稀释，按说明书要求），标记好4、 分装Opti-MEM 20ml 入瓶待用5、 计算好体系：（n为样品数量，N为总样品数量）Mic :45 山 + 600 山 Opti-MEM （12 孔板）-3.75 讪 Mic * n + 50 Opti-MEM * n ;222.5 pl + 300 山 Opti-MEM （24 孑L板 12 个样）-1.875 d Mic * n + 25 Opti-MEM * nNC :45 讪 + 600 讪 Opti-MEM （12 孔板）-3.75 讪 NC * n + 50 讪Opti-ME

4、M * n ;422.5 pl + 300 山 Opti-MEM （24 孔板 12 个样）-1.875 d NC * n + 25 plOpti-MEM * nLP:84 d + 1200 讪 Opti-MEM （12 孔板）-3.5 d LP * N + 50 plOpti-MEM * N ;36 d + 600 d Opti-MEM （24 孔板 12 个样）-1.5 d LP * N + 25 讪Opti-MEM * NInhibitor :190 d + 600 d Opti-MEM （12 孔板）-7.5 讪 inh * n + 50 dOpti-MEM * n ;245 d +

5、300 d Opti-MEM （24 孑L板 12 个样）-3.75 d inh * n + 50 dOpti-MEM * n90 讪 + 600 d Opti-MEM （12 孔板）-7.5 d NC * n + 50 dOpti-MEM * n ;445 d + 300 d Opti-MEM （24 孔板 12 个样）-3.75 d NC * n + 50 dOpti-MEM * n84 d + 1200 讪 Opti-MEM （12 孔板）-3.5 d LP * N + 50 dOpti-MEM * N36 d + 600 d Opti-MEM （24 孔板 12 个样）-1.5 d L

6、P * N + 25 dOpti-MEM * N6、标记好tube管:1mic 45 d + 600 d ； mic 22.5 d + 300 d;3NC 45 d + 600 d；NC 22.5 d + 300 d;5LP 84 讪 + 1200 d；LP 36 d + 600 讪。in 90 d + 600 d : in 45 讪 + 300 d；3NC 90 d + 600 d ； NC 45 d + 300 d ；注意：LP需轻轻混匀，平均分至；平均分至，加后轻轻混匀。静置5min ,拿出接板后的12孔板、24孔板细胞观察。7、将旧培养基吸弃，12孔板 每孔1ml Opti-MEM +

7、 100 d转染液；24孔板 每孔500 dOpti-MEM + 50 山转染液（12个孔）&加完晃匀，6h后换10%FBS，放培养箱42h后换诱导液开始进行诱导五、细胞诱导分化 （全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）配置储备液：IBMX（异丁基-甲基-黄嘌呤）:分子量：222.2g/mol （Sigma:l5879 ） -20 C保存（难溶最后溶）用二甲基亚砜 DMSO 配制111.1mg/ml （0.5mol/L ）储存液即：0.0115g IBMX + 940 ul ddH 2O + 60 ul KOH需用滤嘴过滤至新瓶子终浓度为0.5mmol/L。（现配现用）DEX : 分子量：

8、392.5g/mol （Sigma:D4902 ） -20 C保存用无水乙醇配制1mg/ml（2.5mmol/L） 储存液o.2mg DEX + 0.5ml 无水乙醇终浓度为1umol/L。Insulin : 25mg Insulin + 12.5ml HCl溶解后过滤，PCR小管分装， 终浓度为2ug/ml , -20 C保存。1、 待3T3-L1细胞在24孔板，毎板100讪原细胞体积+400讪10% FBS养2天长满，配制 诱导液 诱导3T3-L1分化。（先配好10%FBS两瓶100ml的）2、 将旧培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，加入配制好的诱导液I每孔500 pl于24孔板 中

9、，培养2天。3、 将培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，用200ul的枪头慢慢加入配制好的诱导液II每孔500讪于24孔板中，培养2天。4、 将旧培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，用10%FBS培养基培养2天。5、 细胞油红0染色的操作步骤：1、10%中性甲醛的配制材料：中性甲醛（多聚甲醛）密封瓶。方法：称取1g中性甲醛粉末，加入10ml的超纯水中，密封，在60度水浴中过夜才能溶解。配 好的溶液1个星期内有效，最好4度保存。2、染色液的配制油红染料、棕色可密封瓶、异丙醇、针筒、滤嘴称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至 100ml，60 C 水浴溶解，棕

10、色瓶密封（或锡箔纸包裹避光）4 C保存，为储存液，可长期保存。用时取 6ml加超 纯水4ml混匀，滤嘴过滤，稀释后数小时内用完。1、 吸弃培养基，用PBS洗2遍，加入10 %的甲醛固定30min1h （贴壁加），期间过滤油红2、 吸弃10%甲醛，用超纯水洗2遍，60%异丙醇孵育5min3、 吸弃60%异丙醇，均匀覆盖oil red O 染20min （6孔板2ml，12孔板1ml , 24孔板500M）4、 吸弃oil red O 后，用超纯水洗25遍，直至无污点5、 加苏木精孵育细胞1min ,吸弃苏木精，超纯水25遍6、 在细胞上加超纯水观察若转染诱导成功，重新转染诱导一批细胞，进行一系列

11、实验：流式细胞术： （无酶枪头、1.5mltube管）注意用前灭菌1、 准备接板好的12孔板细胞、无酶枪头、tube管、96孔板。2、 摆好12个tube管，把原来1ml 10%FBS培养基吸至tube管，一组一枪头，吸1ml PBS 清洗细胞（悬空加）。吸弃 PBS, 组一枪头，吸100150山胰酶消化细胞（两排两排消化）， 显微镜观察第一个，吸弃胰酶，将原培养基从 tube管一一对应吸回去12孔板，并吹匀细胞，轻 轻吹打。显微镜观察是否吹匀。3、 将消化并吹匀的细胞悬液吸回去 tube管，一对一，3000g离心5min。4、 吸上清，留沉淀，大概留 50山，调950山吸弃上清。5、 悬空加

12、入4 C冷却的PBS 1ml，吹匀细胞，3000g 离心5min，吸弃PBS （950山+50讪两次 小心吸弃）。6、 加300山4 C冷却的PBS，吹匀细胞，避免成团。7、 缓慢悬空加入700山预冷的70%无水乙醇，轻轻吹打均匀，4C保存（可一周）。PI染色：1、准备好染色剂、25ml用锡箔纸包好的小瓶、24孔板、锡箔纸。算好体系，多配一个样，加入小瓶备用。现配现用，当天使用， 4 C保存：染色缓冲液 （n+1 ） * 0.5 ml-20 C *碘化丙啶染色液（20x） （n+1 ） * 25山保存RNase A （50x ） （n+1 ） * 10 山 避光配制Total （n+1 ） *

13、 0.535 ml 先加多后加少 容易混匀2、 将样品5000g离心6 min，沉淀细胞。小心吸除上清，850山+50讪吸弃上清，预留50山 左右的乙醇，以免吸走细胞。3、 加入4C PBS，洗涤一次，离心5000g 5 min，沉淀细胞，小心吸除上清，850山+50山吸 弃上清，预留50讪左右的PBS，以免吸走细胞。4、 轻轻弹击tube管底，使细胞分散，避免成团。5、 染色：每管样品中加入0.535 ml染色液，缓慢并充分重悬细胞，37 C避光（样品放入24孔 板用锡箔纸包好）温浴（放烘箱）30min，随后4 C或冰浴避光（样品垂直插入携带冰箱内冰）存放。染色完成后宜24h内或当日完成检测

14、，最好当天完成CV变异系数CV越低，峰值越好，越尖锐，5%左右效果较好，一般V 10%即可提RNA 的收样 （无酶枪头、1.5mltube管）注意用前灭菌1一组组分好不同枪头吸弃培养基，加入 500 d RNAiso放5min。2标记好无酶1.5mltube管，反复刮取、吸取细胞，将细胞移至 tube管（不同组必须换枪 头，移完盖好）。3收样存放-80 C。RNA提取 （无酶枪头、1.5mltube管）1从-80 C冰箱取出样品J 静置 5min 后 12000r，4 C 离心 10min2上清移至新的1.5ml tube管并标记好1J加入丄RNAiso Plus等体积的 氯仿（一般为100

15、d）震荡摇匀53室温静置5minM2000r，4 C 离心 15min4将上清转移至新的tube管并标记好 （150200 d）J加与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀5室温静置10mi nM3000r，4 C 离心 10min6弃上清，向沉淀加入1ml的75%乙醇颠倒清洗沉淀（离心时以管头朝内侧，贝翫淀会附于管外侧，加入乙醇时从内侧，勿触沉淀，设阴性对照，即 横板为dH20）M3000r，4 7弃上清，留沉淀M4000r，4 C 离心 3min9吸走多余的75%乙醇J操作台风干2min10各加入8山DEPC溶解检测纯度：打开软件一按“ Acid 按“否”一选RNAJ每次吸2 pl DEPC先洗3

16、遍，用滤纸弄干用 2 p DEPC 每洗 1 次按 Biank ，MeasureJ洗到 0.5为止每个样品吸2 p，Measure （每测完一次都要擦干）保存（Report ）RNA稀释：（mRNA 定量 C统一为200 miRNA 定量C统一为500 ）V 力口 DEPC取已稀释的RT引物5此加入45山RNA-Free水。准备好96孔板，引物RT, gRT,放在冰上 多配一个体系:miRNA-RT 引物 2 山（n+1 ）U6 RT2 讪（n+1 ）RNA 不少于 1500ng （1500ng/C 统一 =3 山）无菌 ddH 20 4 讪（n+1 ）总体积11讪（n+1 ）RT引物用前稀释

17、；配体系时，RT引物和U6RT的量是固定的，模板和水的量是浮动的；只在一个引物里面加内参；下游引物是通用的；不够的体系用无菌ddH 2O配平；做完样品后保存至-20 C；如果接下来要做miRNA定量，则放在4C备用。样品1样品2样品3样品4样品5样品611 M体系 11 M体系 11讪体系 11 M体系 11 M体系 11 pl体系后对应加入模板（1500ng/C统一二）3 p，标记好，放入小型离心机，离心一下，再放入 PCR 仪70 t10min，冰上 2min （程序：000 ）放一管无酶tube管，多配一个体系，加入体系:5 x buffer5 p （n+1 ）Mix1 p （n+1 ）

18、无菌ddH 2O8 讪（n+1 ）总体积：14p （n+1 ）T14 p体系即总体积:25 p42t 1h，371 15min ， 98 t 5min （程序:0000 ）多配一个体系（n+1 ），混匀，引物瞬时离心:10 p （n+1 ）0.8 p （n+1 ）SYBRFR （通用）ddH 206.4 讪（n+1 ）除去模板2山，总体积18讪（n+1 ）6在冰上铺一次性手套，按96孔板在冰里，放好定量小管，标记好7每个小管对应加18山体系，每个样都要有U6作为参照：cDNA2346miRmiR体系U6U6体系盖上盖子，注意勿污染，用一次性手套隔着按紧定量管盖子，用镊子轻轻撬松定量小管，离心一

19、 下。去杨老师那，打开Real-time机，桌面miRNA pcrd ，然后OK f Next f选第三个f Open Lid ，放样品，用一次性手套按一下，最后 Close Lid f Star Run，选择文件夹命名好保存，直到机器 绿灯亮起，登记好走人。按 1 : 50 比例 力卩 1 pl gDNA Remover 入 50 讪 4 x DNA master mix标记、加样、低速离心，加 2 plRNA进管，RNA热变性5min 65 C,冰上冷却2002、冰上操作，准备好各种规格的无酶枪头、tube管、引物、定量管3、 计算体系，多配2个4、 摆好定量管、tube管，标记好，先加体

20、系（加中间，勿碰壁）5、加样一个对应一种引物6、加盖盖紧，离心好文件夹，保存好，开始Western Blot细胞蛋白收样 （冰上操作、无酶EP管、无酶枪头）1、 n个样，n*2个EP管（一式两份），实验前2-3分钟准备试剂（RIPA、PI）,打冰。2、 把要收的样小心吸弃培 养基，注意一组一枪头。3、 1ml冷冻的PBS清洗，吸弃，换组换枪头。4、 配蛋白裂解液：六孔板 每孔150山十二孔板 每孔100山，多配一点，RIPA: PI=100 : 1 o5、 按体系算好，加入，晃匀，4 C冰箱孵育30min，打开4 C离心机。6、 用200山枪头吸匀刮取后加入至tube管，12000x/g （即

21、12000rcf ）离心15min7、 移上清至新无酶小管（先吸上部分，下部分 10山枪头慢慢吸，维持140山150山），收样完 后-80 C保存。BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。（需先计算体系，即N * 200 ； V 所需 BCA 中的 A 试剂 50* N*200 51 51标准蛋白质溶液：所买试剂浓度 5mg/ml ,用时稀释成1mg/ml的溶液。（从5mg/ml的标准蛋白溶液吸取12.6讪加入50.4山的RIPA共配63讪的1 口g/讪的标准蛋白溶液）实验操作：绘制标准曲线取96孔酶标板，按下表加入试剂。标准曲线的绘制（表1）管号78标准蛋白溶液（卩

22、l）12162063讪RIPA （讪）1918BCA试剂（卩l）蛋白质浓度（mg/ml） 00.0250.050.10.20.30.40.5上述试剂加完后，准确吸取20山样品（10讪样品+ 10讪RIPA ）溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200讪，轻摇，于37 C保温30-60min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上590nm处比色-打开酶标仪，把96孔板盖去掉放进酶标仪并合上，电脑打开 Gen5，点击BCA.pot ,点OK即可导出Excel。以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照， 根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量 -保存Ex

23、cel文件，选中测得标准蛋白溶液吸光度为横坐标，蛋白质浓度为纵坐标，插入 XY散点图，右击表中的散点，添加趋势线，选择多项式，勾选显示公式以及 R平均值。将样品吸光值copy成列，将样品测得吸光值带入公式即可求得C所测样品稀释后浓度， 由于所测20讪样品是10山原样品+10山PBS，即稀释2倍，所以C该样品实际浓度=2 XC所测 样品稀释后浓度，n该样品体系最小物质量=C最小所测体系浓度* V最小浓度体积，V所取体积=n该 样 品 体 系 最 小 物 质 量 /C 该 样 品 体 系 浓 度，VSDS=V所取体积/4V补加ripa = V最小体系浓度体积-V所取体积C稀释后最小浓度* V最小浓

24、度体积 V最小体系浓度体积C所测样品稀释后浓度（V最小浓度体积为测得最小浓度的样品剩下体积；C所测样品稀释后浓度为代入公式后的浓度）蛋白变性在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如 2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同 体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。上样体积 ：5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（Loading Buffer ）=4:1，离心一下，沸水煮 10分钟，以充分变性蛋白。流程图制胶（1h 电泳跑胶（80V 40min 110V 140min & 90V 30min ） 宀转

25、膜（80V 50min& TBST清洗5次（每次5min ）宀封闭（1.5h ）宀TBST清洗5次（每次5min ）宀附I抗（内参：小鼠抗3 -Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜） 宀TBST清洗三次（5min/次附n抗（内参：山羊抗小鼠，轻摇1h TBST清洗三次（5min/次显影物料及配制1、 电泳液：一包电泳粉 +1000ml双蒸水（可回收使用）2、 10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸水3、 转膜液：一包转膜粉+800ml双蒸水+200ml甲醇（可回收使用）4、 TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml 双蒸水+1ml吐温20。（无需回收）5、 封闭液：购买6、 I抗（内参）：将小鼠抗B -Actin ：1稀释液 按1:500稀释待用，4度保存。I抗（目的蛋白58kDa ）:将smad2 :I稀释液 按1:1000稀释待用，4度