3T3L1细胞实验操作Word下载.docx
《3T3L1细胞实验操作Word下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《3T3L1细胞实验操作Word下载.docx(18页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
560山细胞+6ml10%FBS(12个样)【600山分化1.2ml增殖】
12孔板:
1400pl细胞+11ml10%FBS
用25ml瓶一板对一瓶装
1、准备好12孔板、24孔板各两份(两皿细胞)、DMEM、血清、25ml瓶4个、软管。
2、配10%FBS90mlDMEM+10ml血清
3、第一二瓶各6ml10%FBS,第三四瓶各11ml10%FBS
4、吸弃旧培养基,力卩2mlDMEM摇晃清洗,吸弃,500山一皿细胞胰酶消化,显微镜观察细胞分散开来即停止消化。
5、每皿加入2ml10%FBS,1ml枪头打圈吹散。
6、将两皿细胞集中在一个培养皿,打圈吹散。
7、560山细胞分别加入一二瓶混匀,1400山细胞分别加入三四瓶混匀。
8—二瓶对应加500山细胞进24孔板(加12个孔)摇晃混匀,
三四瓶对应加1ml细胞进12孔板,摇晃混匀。
放培养箱,第二天进行转染。
四、细胞转染(无酶EP管、无酶小管、全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭
菌)
1、准Opti-MEM,灭菌水,mic(inhibitor),NC,Lipo3000,无酶EP管、无酶小管,96
孔枪头板,12孔板、24孔板各2板(工具照紫外)
2、NC、mic(inhibitor)4°
C1500r1.5min离心
3、分装Lipo3000tube管150讪一管(轻混),mic(inhibitor)、NC小管(换枪头加灭菌
水稀释,按说明书要求),标记好
4、分装Opti-MEM20ml入瓶待用
5、计算好体系:
(n为样品数量,N为总样品数量)
Mic:
①45山+600山Opti-MEM(12孔板)---3.75讪Mic*n+50^Opti-MEM*n;
222.5pl+300山Opti-MEM(24孑L板12个样)---1.875dMic*n+25^Opti-MEM*n
NC:
③45讪+600讪Opti-MEM(12孔板)---3.75讪NC*n+50讪Opti-MEM*n;
422.5pl+300山Opti-MEM(24孔板12个样)---1.875dNC*n+25plOpti-MEM*n
LP:
⑤84d+1200讪Opti-MEM(12孔板)---3.5dLP*N+50plOpti-MEM*N;
⑥36d+600dOpti-MEM(24孔板12个样)---1.5dLP*N+25讪Opti-MEM*N
Inhibitor:
190d+600dOpti-MEM(12孔板)---7.5讪inh*n+50dOpti-MEM*n;
245d+300dOpti-MEM(24孑L板12个样)---3.75dinh*n+50dOpti-MEM*n
③90讪+600dOpti-MEM(12孔板)---7.5dNC*n+50dOpti-MEM*n;
445d+300dOpti-MEM(24孔板12个样)---3.75dNC*n+50dOpti-MEM*n
⑤84d+1200讪Opti-MEM(12孔板)---3.5dLP*N+50dOpti-MEM*N
⑥36d+600dOpti-MEM(24孔板12个样)---1.5dLP*N+25dOpti-MEM*N
6、标记好tube管:
1mic45d+600d;
®
mic22.5d+300d;
3NC45d+600d;
NC22.5d+300d;
5LP84讪+1200d;
⑥LP36d+600讪。
①in90d+600d:
②in45讪+300d;
3NC90d+600d;
NC45d+300d;
注意:
LP需轻轻混匀,⑤平均分至①③;
⑥平均分至②④,加后轻轻混匀。
静置5min,拿出接板后的12孔板、24孔板细胞观察。
7、将旧培养基吸弃,12孔板每孔1mlOpti-MEM+100d转染液;
24孔板每孔500d
Opti-MEM+50山转染液(12个孔)
&
加完晃匀,6h后换10%FBS,放培养箱42h后换诱导液开始进行诱导
五、细胞诱导分化(全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌)
配置储备液:
IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):
分子量:
222.2g/mol(Sigma:
l5879)-20C保存(难溶最后溶)
用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml(0.5mol/L)储存液
即:
0.0115gIBMX+940ulddH2O+60ulKOH
需用滤嘴过滤至新瓶子
终浓度为0.5mmol/L。
(现配现用)
DEX:
分子量:
392.5g/mol(Sigma:
D4902)-20C保存
用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液
[o.2mgDEX+0.5ml无水乙醇
终浓度为1umol/L。
Insulin:
25mgInsulin+12.5mlHCl
溶解后过滤,PCR小管分装,终浓度为2ug/ml,-20C保存。
1、待3T3-L1细胞在24孔板,毎板100讪原细胞体积+400讪10%FBS养2天长满,配制诱
导液诱导3T3-L1分化。
(先配好10%FBS两瓶100ml的)
2、将旧培养液软管吸弃,PBS清洗,吸弃PBS,加入配制好的诱导液I每孔500pl于24孔板中,培养2天。
3、将培养液软管吸弃,PBS清洗,吸弃PBS,用200ul的枪头慢慢加入配制好的诱导液II每孔
500讪于24孔板中,培养2天。
4、将旧培养液软管吸弃,PBS清洗,吸弃PBS,用10%FBS培养基培养2天。
5、细胞油红0染色的操作步骤:
1、10%中性甲醛的配制
材料:
中性甲醛(多聚甲醛)密封瓶。
方法:
称取1g中性甲醛粉末,加入10ml的超纯水中,密封,在60度水浴中过夜才能溶解。
配好的溶液1个星期内有效,最好4度保存。
2、染色液的配制
油红染料、棕色可密封瓶、异丙醇、针筒、滤嘴
称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉,溶于少量异丙醇中,然后加异丙醇至100ml,60°
C水浴溶解,棕色瓶密封(或锡箔纸包裹避光)4C保存,为储存液,可长期保存。
用时取6ml加超纯水4ml混匀,滤嘴过滤,稀释后数小时内用完。
1、吸弃培养基,用PBS洗2遍,加入10%的甲醛固定30min~1h(贴壁加),期间过滤油红
2、吸弃10%甲醛,用超纯水洗2遍,60%异丙醇孵育5min
3、吸弃60%异丙醇,均匀覆盖oilredO染20min(6孔板2ml,12孔板1ml,24孔板500
M)
4、吸弃oilredO后,用超纯水洗2~5遍,直至无污点
5、加苏木精孵育细胞1min,吸弃苏木精,超纯水2~5遍
6、在细胞上加超纯水观察
若转染诱导成功,重新转染诱导一批细胞,进行一系列实验:
流式细胞术:
(无酶枪头、1.5mltube管)注意用前灭菌
1、准备接板好的12孔板细胞、无酶枪头、tube管、96孔板。
2、摆好12个tube管,把原来1ml10%FBS培养基吸至tube管,一组一枪头,吸1mlPBS清洗细胞(悬空加)。
吸弃PBS,—组一枪头,吸100~150山胰酶消化细胞(两排两排消化),显微镜观察第一个,吸弃胰酶,将原培养基从tube管一一对应吸回去12孔板,并吹匀细胞,轻轻吹打。
显微镜观察是否吹匀。
3、将消化并吹匀的细胞悬液吸回去tube管,一对一,3000g离心5min。
4、吸上清,留沉淀,大概留50山,调950山吸弃上清。
5、悬空加入4C冷却的PBS1ml,吹匀细胞,3000g离心5min,吸弃PBS(950山+50讪两次小心吸弃)。
6、加300山4C冷却的PBS,吹匀细胞,避免成团。
7、缓慢悬空加入700山预冷的70%无水乙醇,轻轻吹打均匀,4C保存(可一周)。
PI染色:
1、准备好染色剂、25ml用锡箔纸包好的小瓶、24孔板、锡箔纸。
算好体系,多配一个样,加入小瓶备用。
现配现用,当天使用,4C保存:
「染色缓冲液(n+1)*0.5ml
-20C*
碘化丙啶染色液(20x)(n+1)*25山
保存
RNaseA(50x)(n+1)*10山避光配制
Total(n+1)*0.535ml先加多后加少容易混匀
2、将样品5000g离心6min,沉淀细胞。
小心吸除上清,850山+50讪吸弃上清,预留50山左右的乙醇,以免吸走细胞。
3、加入4CPBS,洗涤一次,离心5000g5min,沉淀细胞,小心吸除上清,850山+50山吸弃上清,预留50讪左右的PBS,以免吸走细胞。
4、轻轻弹击tube管底,使细胞分散,避免成团。
5、染色:
每管样品中加入0.535ml染色液,缓慢并充分重悬细胞,37C避光(样品放入24孔板用锡箔纸包好)温浴(放烘箱)30min,随后4°
C或冰浴避光(样品垂直插入携带冰箱内冰)
存放。
染色完成后宜24h内或当日完成检测,最好当天完成
CV变异系数CV越低,峰值越好,越尖锐,5%左右效果较好,一般V10%即可
提RNA的收样(无酶枪头、1.5mltube管)注意用前灭菌
1一组组分好不同枪头吸弃培养基,加入500dRNAiso放5min。
2标记好无酶1.5mltube管,反复刮取、吸取细胞,将细胞移至tube管(不同组必须换枪头,移完盖好)。
3收样存放-80C。
RNA提取(无酶枪头、1.5mltube管)
1从-80C冰箱取出样品
J静置5min后12000r,4°
C离心10min
2上清移至新的1.5mltube管并标记好
1
J加入丄RNAisoPlus等体积的氯仿(一般为100d)震荡摇匀
5
3室温静置5min
M2000r,4C离心15min
4将上清转移至新的tube管并标记好(150~200d)
J加与上清液等体积的异丙醇,颠倒混匀
5室温静置10min
M3000r,4C离心10min
6弃上清,向沉淀加入1ml的75%乙醇颠倒清洗沉淀
(离心时以管头朝内侧,贝翫淀会附于管外侧,加入乙醇时从内侧,勿触沉淀,设阴性对照,即横板为dH20)
M3000r,4°
7弃上清,留沉淀
M4000r,4C离心3min
9吸走多余的75%乙醇
J操作台风干2min
10各加入8山DEPC溶解
检测纯度:
打开软件一按“Acid按“否”一选RNA
J每次吸2plDEPC先洗3遍,用滤纸弄干
用2pDEPC每洗1次按Biank,Measure
J洗到0.5为止
每个样品吸2p,Measure(每测完一次都要擦干)
保存(Report)
RNA稀释:
(mRNA定量C统一为200miRNA定量C统一为500)
V力口DEPC
①取已稀释的RT引物5此加入45山RNA-Free水。
准备好96孔板,引物RT,gRT,放在
冰上②多配一个体系:
miRNA-RT引物2山(n+1)
U6RT
2讪(n+1)
RNA不少于1500ng(1500ng/C统一=3山)
无菌ddH204讪(n+1)
总体积11讪(n+1)
RT引物用前稀释;
配②体系时,RT引物和U6RT的量是固定的,模板和水的量是浮动的;
只在一个引物里面加内参;
下游引物是通用的;
不够的体系用无菌ddH2O配平;
做完样品后保存至-20C;
如果接下来要做miRNA定量,则放在4C备用。
样品1
样品2
样品3
样品4
样品5
样品6
11M体系②11M体系②11讪体系②11M体系②11M体系②11pl体系②
③后对应加入模板(1500ng/C统一二)3p,标记好,放入小型离心机,离心一下,再放入PCR仪
70t
10min,冰上2min(程序:
000)
④放一管无酶
tube管,多配一个体系,加入体系:
5xbuffer
5p(n+1)
Mix
1p(n+1)
无菌ddH2O
8讪(n+1)
总体积:
14
p(n+1)
T
14p体系④
即总体积
:
25p
42t1h,
37115min,98t5min(程序:
0000)
⑤多配一个体系(n+1),混匀,引物瞬时离心:
10p(n+1)
0.8p(n+1)
SYBR
F
R(通用)
ddH20
6.4讪(n+1)
除去模板2山,总体积18讪(n+1)
6在冰上铺一次性手套,按96孔板在冰里,放好定量小管,标记好
7每个小管对应加18山体系⑤,每个样都要有U6作为参照:
cDNA
2
3
4
6
miR
miR体系⑤
U6
U6体系⑤
盖上盖子,注意勿污染,用一次性手套隔着按紧定量管盖子,用镊子轻轻撬松定量小管,离心一下。
⑧去杨老师那,打开Real-time机,桌面miRNApcrd,然后OKfNextf选第三个fOpenLid,
放样品,用一次性手套按一下,最后CloseLidfStarRun,选择文件夹命名好保存,直到机器绿灯亮起,登记好走人。
①按1:
50比例力卩1plgDNARemover入50讪4xDNAmastermix
②标记、加样、低速离心,加2plRNA进管,RNA热变性5min65C,冰上冷却
200
2、冰上操作,准备好各种规格的无酶枪头、tube管、引物、定量管
3、计算体系,多配2个
4、摆好定量管、tube管,标记好,先加体系(加中间,勿碰壁)
5、加样一个对应一种引物
6、加盖盖紧,离心
好文件夹,保存好,开始
WesternBlot
细胞蛋白收样(冰上操作、无酶EP管、无酶枪头)
1、n个样,n*2个EP管(一式两份),实验前2-3分钟准备试剂(RIPA、PI),打冰。
2、把要收的样小心吸弃培养基,注意一组一枪头。
3、1ml冷冻的PBS清洗,吸弃,换组换枪头。
4、配蛋白裂解液:
六孔板每孔150山十二孔板每孔100山,多配一点,RIPA:
PI=100:
1o
5、按体系算好,加入,晃匀,4C冰箱孵育30min,打开4C离心机。
6、用200山枪头吸匀刮取后加入至tube管,12000x/g(即12000rcf)离心15min
7、移上清至新无酶小管(先吸上部分,下部分10山枪头慢慢吸,维持140山~150山),收样完后-80C保存。
BCA试剂:
取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。
此试剂可稳定一周。
(需先计算体系,即
N*200^■;
V所需BCA中的A试剂50*N*200^■
51'
51
标准蛋白质溶液:
所买试剂浓度5mg/ml,用时稀释成1mg/ml的溶液。
(从5mg/ml的标准
蛋白溶液吸取12.6讪加入50.4山的RIPA共配63讪的1口g/讪的标准蛋白溶液)
实验操作:
绘制标准曲线
取96孔酶标板,按下表加入试剂。
标准曲线的绘制(表1)
管号
7
8
标准蛋白溶液(卩l)
12
16
20
63讪
RIPA(讪)
19
18
BCA试剂(卩l)
蛋白质浓度(mg/ml
)0
0.025
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
上述试剂加完后,
准确吸取
20山样品
(10讪样品
+10讪
RIPA)溶液于酶标孔中,加入
BCA试剂
200讪,轻摇,于
37C保温
30-60min
,冷却至室温后,
以空白为对照,在酶标仪上
590nm
处
比色---
打开酶标仪,把96孔板盖去掉放进酶标仪并合上,电脑打开Gen5,点击BCA.pot,点
OK即可导出Excel。
以牛血清白蛋白含量为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。
以标准曲线空白为对照,根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量----
保存Excel文件,选中测得标准蛋白溶液吸光度为横坐标,蛋白质浓度为纵坐标,插入XY
散点图,右击表中的散点,添加趋势线,选择多项式,勾选显示公式以及R平均值。
将样品吸光值copy成列,将样品测得吸光值带入公式即可求得C所测样品稀释后浓度,由于所测20讪样品是10山原样品+10山PBS,即稀释2倍,所以C该样品实际浓度=2XC所测样品稀释后浓度,n该样品体系最小物质量=C最小所测体系浓度*V最小浓度体积,V所取体积=n该样品体系最小物质量/C该样品体系浓度,
VSDS=V所取体积/4
V补加ripa=V最小体系浓度体积-V所取体积
C稀释后最小浓度*V最小浓度体积V最小体系浓度体积
C所测样品稀释后浓度
(V最小浓度体积为测得最小浓度的样品剩下体积;
C所测样品稀释后浓度为代入公式后的浓度)
蛋白变性
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
上样体积:
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液
(LoadingBuffer)=4:
1,离心一下,沸水煮10分钟,以充分变性蛋白。
流程图
制胶(1h电泳跑胶(80V40min110V140min&
90V30min)宀转膜(80V50min&
TBST
清洗5次(每次5min)宀封闭(1.5h)宀TBST清洗5次(每次5min)宀附I抗(内参:
小鼠抗3-Actin,
先摇床轻摇30min,再放冰箱4度过夜)宀TBST清洗三次(5min/次附n抗(内参:
山羊抗小
鼠,轻摇1hTBST清洗三次(5min/次显影
物料及配制
1、电泳液:
一包电泳粉+1000ml双蒸水(可回收使用)
2、10%过硫酸铵:
1g过硫酸铵+10ml双蒸水
3、转膜液:
一包转膜粉+800ml双蒸水+200ml甲醇(可回收使用)
4、TBST溶液:
50ml20*TBS+950ml双蒸水+1ml吐温20。
(无需回收)
5、封闭液:
购买
6、I抗(内参):
将小鼠抗B-Actin:
1稀释液按1:
500稀释待用,4度保存。
I抗(目的蛋白58kDa):
将smad2:
I稀释液按1:
1000稀释待用,4度