最佳呼吸机设置的生理和病理学基础.ppt

1、第四军医大学西京医院心血管外科最佳呼吸机设置的生理最佳呼吸机设置的生理和病理学基础和病理学基础西京医院心血管外科西京医院心血管外科ICU ICU 崔崔 勤勤第四军医大学西京医院心血管外科 为什么必须改变呼吸机设置的理念为什么必须改变呼吸机设置的理念?第四军医大学西京医院心血管外科为什么需要肺复张治疗为什么需要肺复张治疗?第四军医大学西京医院心血管外科死亡率变化趋势死亡率变化趋势第四军医大学西京医院心血管外科为什么需要改进为什么需要改进ALIALI和和ARDSARDS定义定义?第四军医大学西京医院心血管外科患者特征患者特征（ARDSARDS定义）定义）急性发作急性发作在不考虑在不考虑PEEP水平

2、的情况下水平的情况下PaO2/FiO2200 mmHg胸部正位胸部正位X线或线或CT示双侧浸润示双侧浸润PAWP18 mmHg或无左房高压的临床证据或无左房高压的临床证据第四军医大学西京医院心血管外科2.12.1患者特点患者特点原理：为什么不完全接受原理：为什么不完全接受ARDSARDS的的AECCAECC定义？定义？急性发作急性发作胸部正位胸部正位X线或线或CT示双侧浸润示双侧浸润PAWP18 mmHg或无左房高压的临床或无左房高压的临床证据证据第四军医大学西京医院心血管外科第四军医大学西京医院心血管外科病毒载体非病毒载体引起免疫反应容量小、制备困难无靶向性裸DNA直接注射磷酸钙共沉淀脂质体

3、设备昂贵不适合大量细胞的转染转染率低已很少使用细胞毒性抑制外源基因的表达致DNA失活纳米材料第四军医大学西京医院心血管外科壳聚糖的研究现状体外转染安全高效大鼠体内实验表明半乳糖基化壳聚糖有肝靶向性大型动物体内基因转导实验尚无文献报道研究背景研究背景第四军医大学西京医院心血管外科三、研 究 内 容研究内容研究内容大量提取大量提取纯化质粒纯化质粒chitosan纳米微囊纳米微囊体外转染体外转染7721细胞细胞GdCl3 iv体内注射体内注射取主要脏器组取主要脏器组织，检测报告织，检测报告基因表达基因表达第四军医大学西京医院心血管外科第一部分第一部分研究内容研究内容壳聚糖质粒DNA复合物的制备第四军

4、医大学西京医院心血管外科 实实 验验 方方 法法质粒的酶切鉴定研究内容研究内容图2.pEGFP-N1质粒图谱，下方为MCR第四军医大学西京医院心血管外科研究内容研究内容图3.pBIND质粒图谱，右侧为其MCR第四军医大学西京医院心血管外科研究内容研究内容质粒的大量提取与纯化 QiagenTM Endo-Free plasmid Giga Kits 无内毒素纯度2氯化铯梯度抽提 第四军医大学西京医院心血管外科壳聚糖壳聚糖DNADNA复合物（纳米微囊）的制备复合物（纳米微囊）的制备研究内容研究内容质粒质粒DNA50mmol/L Na2SO40.02chitosanVertex(2500rpm)30

5、s第四军医大学西京医院心血管外科实实 验验 结结 果果研究内容研究内容 1 2 M图4.质粒酶切产物电泳图。1为pBIND，2为pEGFP-N1，M为DNA 100bp ladder Marker67bp34bp第四军医大学西京医院心血管外科研究内容研究内容M 1 2 3 4图5.纳米微囊及质粒DNA电泳图。M为marker，1、3分别为pEGFP-N1，pBIND质粒DNA，2、4分别为含pEGFP-N1/pBIND 的纳米微囊 第四军医大学西京医院心血管外科壳聚糖壳聚糖DNADNA在在77217721肝癌细胞中的表达肝癌细胞中的表达研究内容研究内容第二部分第二部分第四军医大学西京医院心血管

6、外科实实 验验 方方 法法研究内容研究内容细胞培养与细胞爬片制作SMMC-7721细胞0.25胰酶消化，加 1-2 滴至 12 孔板中的盖玻片上，37孵箱放置 1 h，使细胞贴壁第四军医大学西京医院心血管外科研究内容研究内容用壳聚糖质粒（pEGFP-N1）纳米微囊转染，以脂质体LipofectamineTM 2000包裹相同的质粒作为阳性对照转染第四军医大学西京医院心血管外科检测报告基因表达情况DAPI溶液染色荧光显微镜下观察在同一视野下，分别计数绿色荧光蛋白表达的细胞数和DAPI染色的细胞数，计算转染率研究内容研究内容第四军医大学西京医院心血管外科统计学分析：所得数据处理用SPSS11.5统

7、计软件进行统计学处理，用两样本均数比较的 t 检验p0.05为差异有统计学意义研究内容研究内容第四军医大学西京医院心血管外科实实 验验 结结 果果图6.7721细胞中GFP的表达200 图7.7721细胞DAPI染色200研究内容研究内容第四军医大学西京医院心血管外科表表1 壳聚糖组和脂质体组的转染率（）壳聚糖组和脂质体组的转染率（）壳聚糖组脂质体组58.354.760.42.2*55.61.6分组视野2转染率值 *p0.05 vs 脂质体组 SS研究内容研究内容视野3视野162.860.257.554.6第四军医大学西京医院心血管外科讨讨 论论本实验结果提示壳聚糖体外转染的效率略高于转染试剂

8、脂质体，说明壳聚糖是一种有效的体外转染材料,为下一步体内实验打下良好的基础 研究内容研究内容第四军医大学西京医院心血管外科壳聚糖肝靶向性基因转导体内实验研究内容研究内容第三部分第三部分第四军医大学西京医院心血管外科 实实 验验 方方 法法实验动物与分组 研究内容研究内容杂种犬6只，第四军医大学实验动物中心随机分为2组实验组注射壳聚糖质粒纳米微囊对照组仅注射裸质粒第四军医大学西京医院心血管外科术前准备 研究内容研究内容手术前1d静脉注射氯化钆，清除Kupffer细胞 第四军医大学西京医院心血管外科研究内容研究内容图8.动物手术示意图第四军医大学西京医院心血管外科图9.动物手术图示，A为解剖肝门部

9、，B为注射壳聚糖-DNA复合物 研究内容研究内容AB第四军医大学西京医院心血管外科研究内容研究内容48h后处死动物，取肝、心、脾、肺、肾组织，作冰冻切片 滴少许甘油碳酸盐缓冲液，放置盖玻片。置于荧光显微镜下，观察绿色荧光蛋白的表达情况第四军医大学西京医院心血管外科研究内容研究内容实实 验验 结结 果果图10.肝组织中GFP的表达，可观察到黄绿色荧光 200第四军医大学西京医院心血管外科A.心B.肺D.脾C.肾图11.其他组织无阳性荧光表达 200 第四军医大学西京医院心血管外科壳聚糖（chitosan）的优点资源丰富生物可降解性无免疫原性靶向性保护DNA免受DNase的降解研究内容研究内容讨讨

10、 论论第四军医大学西京医院心血管外科图12.壳聚糖具有肝靶向性的原理示意图研究内容研究内容第四军医大学西京医院心血管外科关于壳聚糖在大型动物体内的基因转导，国内外尚无文献报道 壳聚糖通过纳米微囊表面携带的正电荷与细胞膜上携带负电荷的糖蛋白及磷脂的相互作用引发细胞胞吞作用而进入细胞。而且，壳聚糖能包裹、浓缩DNA，使DNA免受DNase的降解 研究内容研究内容第四军医大学西京医院心血管外科经肝动脉和门静脉注射的给药途径，临床上有可行性 如果用适当的功能基因替换报告基因,预期相应的基因也可以表达,并可能达到一定的治疗效果 研究内容研究内容第四军医大学西京医院心血管外科小小 结结本实验以壳聚糖与质粒制备成纳米微囊复合体，体外转染7721细胞，结果表明壳聚糖有较高的体外转染效率体内实验通过肝动脉、门静脉联合给药，在肝检测到较高的绿色荧光蛋白表达水平首次在大型动物体内完成壳聚糖介导的外源性基因表达小小 结结第四军医大学西京医院心血管外科致致 谢谢衷心感谢我的导师窦科峰教授在学习生活过程中的照顾和教导感谢陈勇教授在实验过程中的指导和帮助感谢肝胆外科各位专家教授和老师们在临床工作中的指导和帮助感谢新加坡约翰 霍普金斯大学毛海泉教授及其学生对实验的帮助衷心感谢病理实验室、动物实验中心、肝胆外科实验室的老师、同学们对实验的帮助致致 谢谢第四军医大学西京医院心血管外科