新一代测序技术的发展现状Word文档下载推荐.docx

1、但是，对于 454测序仪而言，用户至少可以通过更新的软件从原始数据得到质量更高的序列，从而提高碱基识别分辨率， 减少误差。除数据处理问题之外，研究人员还需要拥有一个足够强大的计算机平台，以便将 来自多个测序技术的短小基因片段进行组合，形成基因组外显子。目前问题在 于，测序仪生产商仅仅提供用于某些特定基因信息分析的软件，如靶标重测序、 基因表达分析、染色质免疫沉淀反应或基因组从头测序等，而并未提供任何其它 类型的下游生物学信息分析软件。研究界越来越熟悉这些测序平台对循证生物学 的巨大潜力，这也就产生了新的研究问题以及全新类型的试验方法，而这单凭依 赖目前的生物学信息是无法满足的。从这个角度看，S

2、OLiD 软件研发公司（ 七月刚刚兼并了两个新的软件公司，这一举动无疑朝正确的方向迈进了一步。该 公司在开放源码许可证下开发软件分析工具，目的就是为了给生物信息学领域提 供支持，并为其开发新的算法。衍*SOLiD Soflwurt Orw阳砂卅CWWCitfUKiDn-营 MHtofflMn 切 Wk 丽 M 加 kMlHht 魚Ri贺 心打卄 口厂：卜 J 亠：邛LJ. AM （MriltoflMPl CamHUkly M iAUk nw idimpkii did W Mil ptMiuati iMtii ta 僅t 倉（良田巾 Thi 事lil 痹F IhA 4 世C 二也 Feri 卜

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4、前以测序平台为核心的 市场竞争激烈，因此每个生产商都努力提供最好的数据结果。在这样的大环境下，对数据及不同产品的比较结果进行标准化，便显得尤为重 要。有一个方法可以更好地对不同的新一代测序技术进行比较，那就是建立一个 微阵列定性分析小组（ Microarray Quality Control consortium ），不仅可以对不同 的技术结果进行比较 ，而且还可以将新技术结果与 DNA 微阵列或定量 PCR 进行 比较。综合以上各类因素，可以预见的是，新一代测序平台在近几年内，仍然会局限于 少数实验室及研究者 ，而大多数缺少能够对基因信息进行进一步分析的实验室则 无法从新测序技术中获益。对大

5、多数实验室而言，即使新一代的测序平台能够提 供更多的信息， DNA 微阵列分析仍然是一个相对便宜的选择。例如，在转录分 析中，虽然新一代测序结果不仅能给出具有很大动态范围的基因丰度信息，同时 还可提供剪切变异信息以及 SNP 数据，但是这些数据结果都需要进行不同的 DNA 微阵列分析才能获得。那么，有没有什么方法可以解决这些问题呢？首先，相关的资金授予机构应该对 生物信息学的发展予以与测序技术同等的关注；此外，由于生物信息学发展中的 瓶颈已经限制了测序机器的销售，测序仪生产商也应该联合起来解决这一难题。 同时，制造商应该致力于制定以研究领域为基础而不是以不同公司为基础的生物 信息学解决方案。因

6、此，如果新一代测序平台真的能够带动基因组测序 “普及化 ”让基因组测序 从大型测序中心走入每个研究人员的实验室或者小型研究小组 ，那么还需要研究 人员付出更多努力，开发出经济实惠的分析软件以及数据管理系统。目前的状况 是，与新一代测序技术相关的生物信息学分析工作仅仅掌握在少数人手里，但是 这一具有重要价值的技术毫无疑问应该由大多数人掌握 。如果数据处理问题不能 得到有效解决，那么 ABI 公司的 SOLiD 系统、 454 公司的超高通量基因组测序 系统 GS FLX、Illumina 公司的 GAII 系统等新一代测序仪就永远无法真正出 现在能够展现其价值的舞台上。原文检索：Editoria

7、l. （2008） Prepare for the deluge. Nature Biotech nology, 26（10）:1099.、传统的DNA测序技术 Sanger测序法自上世纪90年代初，所有的DNA测序操作几乎无一例外地全部采用半自动化 毛细管电泳San ger测序法（图1a）。而后来出现的高通量测序方法则首先采用 以下两种方法中的一种对DNA进行预处理（表1）。吐沬也可児丰从牍扼應的葛枪決（1 hatgun wiuenting） * 大量盧机仍劄产生的口NA一、分孑+股吏遽刎娶舞贝垓雯杜：尉松炮型匿芯；七，馬质厲堆这些吏社丙子天履立爲辅代：二港垦在时峙宦序机逡尸再衣加淳E使同的

8、方法.的强国该苹定.丰弗的特耳引福进厅FCR扩曙，丛= 转冉滾尹死无论采用以上哪种方法处理后，我们均可以得到大量的待测序模板片段 一一质粒 或PCR产物。随后，测序仪会进行 循环测序”反应。在每一轮测序反应的引物 延伸步骤中，会随机引入已被四种不同颜色荧光分别标记的 ddNTP（ ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP）以终止延伸反应。这样就形成了大量末端被荧光标记 的、长短不一（终止位点不同）的延伸产物。接着，再用高分辨率的毛细管凝胶 电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，计算机 软件会自动 读出” DNA序列。不过，该方法在 读取”每一个碱基信息时都有可

9、能出错。后续操作中，比如基因组组装或者找出变异位点等就是具体情况具体解 决了。一般，这种高通量测序仪一次最多只能同时进行 96个或384个样品测序。San ger DNA测序技术经过了 30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达 1,000bp的DNA片段进行测序了，而且对每一个碱基的读取准确率高达 99.999%。在高通量基因组鸟枪法测序操作当中，使用 San ger测序法的费用大约为0.5美元/1,000个碱基。Jay She ndure & Han lee Ji. （2008） Next-ge neration DNA seque ncing. Nature Biotech nology

10、, 26（10）:1135-1145.、新一代DNA测序技术DNA测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借 助高通量DNA测序技术予以解决。过去三年，大规模平行测序平台（ massivelyparallel DNA sequencing platform）已经发展为主流的测序技术，这项测序技术 的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前 专属于大型测序中心的 特权”能够被众多研究人员分享。目前，新的测序技术 及手段还在不断涌现，比如最新的进展就包括建立序列数据库、建立序列数据 分析新方法以及设计测序试验等等。新一代 DNA测序技术有助于人们以

11、更低廉 的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各 项数据。今后，各种测序将成为一项广泛使用的常规实验手段，这有望给生物 学和生物医学研究领域带来革命性的变革。DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程。迄今为止，我们获得的绝大部分 DNA序列都是基于San ger测序法获得的。在过去5年间，人们至少从以下四个 方面刺激了 DNA测序技术的发展（表2）。划的H琨.色K的i?離旬麵.无论却賀恍化，也无 法K謀蘆2低刃.厲養闰：它王委IS弍王鸣春考丰軻截的建立曜出握户證件图咸月可魅.送楹7：宦促土T短甘段泓不断循廳的新製分于王夠学技K翟龙址促主丁井子生商羊的握醍馬之鬥兴的越

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13、pplied Biosystems公司的 SOLiD 测序仪、Dover/Harvard 公司的Polonator测序仪以及美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪。所有 这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略一一循环芯片测序法（cyclic-arraysequencin，也可将其称为新一代测序技术或者第二代测序技术所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满 DNA样品的芯片重复进行基于 DNA 的聚合酶反应（模板变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。2005 年，有两篇论文曾对这种方法做出过详细介绍。与传统测序法相比，循环芯片测 序法具有操作更简易、费用更低廉的优势，于是很

14、快就获得了广泛的应用。至：菁至西宫4%Sr.店決展甘一件DN.h：.弐氏朮工惟淳雯匪.D） 盲先豪因山DN阳片井于.掛着集事小片殴DNA4E克雕人擱粒鞍刘后磅弋孔大境F醤单量后荷無丈屋籽暂理辺质忙 进怎耶一屮谶序舷塞只总江橄升的反瘦体累丰 男职-醫即垂藝呷一戻弭董不一齡索遂卿记斗应光的咎鼠-矗吾谢忑讯畴一牛延1更逼产椁末養光月晝进眄沢 别秦當黑DN稿屛b）鸟枪环书片斥曙.片为于.攜焉存這童小片鼠 DMA甘芋的末医连播上音壽前摂耳星言黑達埜小片ftDNA#子|疫昨期若片.蓦一冲pOta呷中挥*有f小片段 qna井于眄诈雰伞琲叽.二琴这匸凳覚二集會弃一起卜毒立了zrft=rAiiit?rfts 哄

15、嗣lx厚.需臣导勻刊槨語申一棒.爵辽討畫一 14E抑瓦应n案罠光粗色iTVUMlM出口仙列S 厦上込妒眾芳能莊;完S!羔序詐.虽然这些新一代测序仪以及芯片的实际制作过程似乎都和传统的测序方法有很 大的不同，而且各有特点（表3）,但实际上它们背后的原理和技术都是非常相 似甚至是相同的（图1b）。新一代测序法首先也是将基因组 DNA随机切割成小 片段DNA分子，然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库，也 可以使用配对标签（mate-paired tag制成跨步文库（jumping libraries）。随后可以通过原位 polony （in situ polony,小词典 1）、微乳液

16、 PCR （emulsion PCR） 或桥式PCR （bridge PCR）（图5）等方法获得测序模板。上述方法有一个共同点，那就是任何一个小片段DNA分子的PCR扩增产物都是 在空间上聚集的：原位polony法和桥式PCR法中所有的产物都集中在平板的某 处，在微乳液PCR法（emulsion PCR）中所有的产物都集中在微珠的表面。真 正的测序反应本身和传统测序法一样，是由重复的聚合酶促反应和最后的荧光读 取分析反应组成（图6）。本文讨论的所有测序仪都是使用合成测序法 （sequencing by synthesis），即通过聚合酶或连接酶不断地延伸引物获得模板序列，最后对每 一轮反应的结

17、果进行荧光图像采集、分析，获得序列结果。丧新一代测主技斗的舞戸为井磅進DMA丈RS后悻外蕙怪扩福侍T.DK4片说.这畝单决【传茨吕白射和JL爭損K =垛几屣隨剧 三巴加.雯珂環的幕葯艺IT弗抑转化X场坪基二理曙燃吏瞳挑送萋可惡：墓子芯片的加庐方蛊離槻大炮提荷平行离挣的観力-虫芋每一几存妁口+.片用克些购氏轻鄴K型 I nm,医此可叹衽芯片上同诃两上忆入得淑片职沮疔汕净*云土骂一八洋活.口人片忌豆遼都网运在芯片上的叵足烂茧 园丘可臥一沈对芯片上的弗有片魏喳厅刃 ffT WRW要厦禺几塾产的总轟医应试剂.速熬相些干毎一a粹泓片般只氓用？几皮沖:或 几飞f- iFtmtoiiaj； 试叭 从“馥大陽

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19、样品准备步骤，将以往 转化大肠杆菌扩增质粒的繁琐过程全部用简单的体外 PCR扩增法替代了；最后，它缩小了测序反应体积，节省了试剂。这样， 454测序仪做到了以极其低廉的价格进行大规模平行测序反应。它的测序规模之大、测序费用之低是以往的测 序仪无法匹敌的。454测序仪与其它的新一代测序仪一起，降低了测序检测的费 用，推动了测序技术平民化进程，使得小实验室也能开展测序检测项目，打破了 以往只有少数几个大型测序中心才能进行测序研究的 垄断地位”在过去的18个月里，由于有了 454测序仪的帮助，人们对人类基因组的结构有了更深入的了 解，同时第一次使用非 San ger测序法对个人进行了测序，还建立了一

20、种发现小 RNA的新方法。不过，要能让更多的人使用上新一代的测序产品，它们还需要 变得更便宜，并且更加容易操作。在一段时间之内， 454测序仪必定会进一步降低测序费用，帮助人们迎接个人基因组时代的到来。自从诺贝尔奖得主 Frederick Sanger和Walter Gilbert （图2）分别发明了链终止 法 DNA 测序技术（seque ncing by cha in termi nation tech nique）和链断裂法 DNA 测序技术（sequencing by chain fragmentation technique） 之后，人们就一直希望 能够扩大DNA测序技术的处理规模。

21、至打今天，我们对测序技术的需求和对计 算机技术的需求一起出现了迅猛的增长，因为测序技术的发展速度已经远远跟不 上实验要求的增长速度。于是出现了好几种替代San ger测序法的新型测序方法， 比如杂交测序法、借助原子力显微镜（atomic force microscopy）直接DNA成像 测序法（direct imaging of DNA sequenee）、质谱分析法、合成测序法以及微液 流测序法等等。在我们进行人类基因组计划时还出现了三项技术改进方法，即使 用荧光标记物取代了放射性标记物来标记终止碱基 （双脱氧碱基）；使用毛细管电泳（capillary electrophoresis）取代了

22、传统的平板凝胶电泳；建立了末端配对测 序法（paired-end sequencing来对质粒、fosmid、人工细菌染色体（BAC）等短 片段序列进行测序，解决了测序长度带来的限制问题。同时，开展研究的自动化 液体分装技术（liquid-handling robotics ）帮助我们摆脱了人工试管操作，可以用 自动化的方式在微量滴定板（microtiter plate）上装载待测序样品（质粒等）， 极大地降低了测序的费用和劳动强度。随着美国454 Life Sciences公司（该公司现已被美国罗氏公司收购）的第一台新 一代测序仪一一454测序仪的面世，我们获得了一种完全不同的测序方式。 4

23、54 测序仪引领的新一代测序技术在一直困扰传统测序技术的三个瓶颈问题上取得 了突破。这三个问题分别是文库制备、模板制备和测序。而且，在随后出现的其 它新一代测序仪产品身上，我们或多或少都会发现在 454 测序仪上使用到的技 术，这也足以说明 454 测序仪的技术创新的确取得了巨大的成功。454 测序仪的先行者地位使它对整个测序业的影响远远超过了其它新一代测序 仪竞争对手。这一点从 Leamon、Rothberg 等人撰写的一篇介绍 2005 年技术进 展的论文被引用了 570 多次的事实，以及有 100 多篇经过同行审议的关于人类遗 传学、代谢组学、生态学、进化学以及古生物学的论文 （ pee

24、r-reviewed publications） 都是使用 454测序仪开展的研究多个事实中都能够得到证明。 454 测序仪技术是 继 Sanger 测序技术之后出现的第一个用于对细菌基因组进行从头测序的新技 术，也是第一个被用来对人类基因组进行测序的非 Sanger 测序技术。其它使用 454 测序仪开展的重要研究项目包括探究蜜蜂消失原因的项目、研究人类基因组 重排复杂性的项目 、建立用于研究传染性疾病新方法的项目以及对尼安德特尔人 （ Neandertha）l 基因组的测序项目等。1.1.1 摩尔定律对 454 测序仪的影响454测序仪的迅猛发展不是因为我们想要 San ger测序仪小型化

25、,而是因为新型奔腾芯片的出现以及摩尔定律法则给我们带来的希望。很明显，常规的人类基因测 序项目会对我们处理测序技术的能力提出更高要求 ，这与我们对计算机处理能力 的要求是一样的。不过，只有将计算机的电子管换成晶体管，才为后来集成电路 技术的发展提供了可能，这正是计算机产业发展的关键所在。而希望对传统的毛 细管电泳技术进行改良，提高它的速度和处理规模，正如只用电子管直接制作集 成电路一样不可能。因此，如果将各种测序技术比作一个个晶体管，将一系列测 序步骤整合起来比作集成电路，那么也就可以用摩尔定律来预测 DNA 测序技术 的发展速度了。合成测序法概念虽然在提出的时候还不算成功 ，但它的出现为测序

26、仪小型化奠定 了基础。基于合成测序法出现了两种策略 ：一种是循环可切除终止测序法 （ cyclic reversible term in ation tech nology）,即依次逐个添加荧光标记的碱基，继而检测 荧光信号，切除荧光基团，如此往复；另一种策略是焦磷酸测序法 （sequenced by detecting pyrophosphate releas）e 。 454测序仪采用的正是焦磷酸测序法，因为它 似乎比第一种方法的效率更高。结果证明， 454 公司的选择是正确的。 454 测序 仪采用的是小型化焦磷酸测序反应 ，测序模板准备和焦磷酸测序反应步骤都是在 固态芯片上完成的。实际上

27、，早在上世纪 90 年代中期，焦磷酸测序技术就已经被科研界用来进行基 因分型工作了，但那时的焦磷酸测序技术还不能够满足标准的测序实验要求，因 为它的测序长度太短，因此只能用于旨在发现 SNP 的基因分型研究当中。当时 进行基因分型操作时，是在微量滴定板（microtiter plate）上进行的，可以连续 进行最多 96 次基因分型实验，平均每个样品花费 20美分。那时焦磷酸测序还不 能用于从头测序工作 ，因为从头测序需要对每一个尤其是第一个碱基都能准确地 区分清楚，而焦磷酸测序只能简单地对已知位点的碱基进行检测，而且从头测序 要求的测序长度也是焦磷酸测序法无法达到的。不过，由于焦磷酸测序的原

28、理是通过检测碱基掺入时发出的光来进行测序的 （图 3），所以它并不需要类似于电泳之类的物理分离过程来对碱基进行区分。这也 就是说焦磷酸测序仪可以 “缩小（减） ”到只需要检测光线就够了，而不需要像传 统的测序仪还需要电泳设备，而这正是限制传统电泳仪小型化的关键所在。发光 检测方法还能够进行多路平行操作，但是直到 454 测序仪出现之前，还没有人这 样做过，以前都是依次进行检测的。和晶体管早期的遭遇一样 （当时人们也怀疑 晶体管替代不了电子管） ，人们同时对高密度的，用于并行焦磷酸测序的反应也 充满了疑问。不过，当我们不再在溶液中进行测序反应，而是将测序模板、所有 的试剂（酶）都固定在平板上制成芯片之后，就获得了小型化的，能进行多路并 行处理的测序仪，这就与晶体管被小型化并整合成 集成电路的过程一样。此外，借助微量滴定板上一个个的小孔所达到的将不同测 序反应进行分隔这一目的，也能通过在单个固相支持物上进行严密包裹（隔离） 的反应来实现。在这些各自隔绝的反应体系中，链聚合反应速度和