新一代测序技术的发展现状Word文档下载推荐.docx
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但是，对于454测序仪而言，用户至少可
以通过更新的软件从原始数据得到质量更高的序列，从而提高碱基识别分辨率，减少误差。
除数据处理问题之外，研究人员还需要拥有一个足够强大的计算机平台，以便将来自多个测序技术的短小基因片段进行组合，形成基因组外显子。
目前问题在于，测序仪生产商仅仅提供用于某些特定基因信息分析的软件，如靶标重测序、基因表达分析、染色质免疫沉淀反应或基因组从头测序等，而并未提供任何其它类型的下游生物学信息分析软件。
研究界越来越熟悉这些测序平台对循证生物学的巨大潜力，这也就产生了新的研究问题以及全新类型的试验方法，而这单凭依赖目前的生物学信息是无法满足的。
从这个角度看，SOLiD软件研发公司（七月刚刚兼并了两个新的软件公司，这一举动无疑朝正确的方向迈进了一步。
该公司在开放源码许可证下开发软件分析工具，目的就是为了给生物信息学领域提供支持，并为其开发新的算法。
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3罕応F.对用户而言，如果能够将数据格式与不同测序平台获得的结果进行比较所得的统计数字进行标准化，无疑具有重大的意义。
特别是由于目前以测序平台为核心的市场竞争激烈，因此每个生产商都努力提供最好的数据结果。
在这样的大环境下，对数据及不同产品的比较结果进行标准化，便显得尤为重要。
有一个方法可以更好地对不同的新一代测序技术进行比较，那就是建立一个微阵列定性分析小组（MicroarrayQualityControlconsortium），不仅可以对不同的技术结果进行比较，而且还可以将新技术结果与DNA微阵列或定量PCR进行比较。
综合以上各类因素，可以预见的是，新一代测序平台在近几年内，仍然会局限于少数实验室及研究者，而大多数缺少能够对基因信息进行进一步分析的实验室则无法从新测序技术中获益。
对大多数实验室而言，即使新一代的测序平台能够提供更多的信息，DNA微阵列分析仍然是一个相对便宜的选择。
例如，在转录分析中，虽然新一代测序结果不仅能给出具有很大动态范围的基因丰度信息，同时还可提供剪切变异信息以及SNP数据，但是这些数据结果都需要进行不同的DNA微阵列分析才能获得。
那么，有没有什么方法可以解决这些问题呢？
首先，相关的资金授予机构应该对生物信息学的发展予以与测序技术同等的关注；
此外，由于生物信息学发展中的瓶颈已经限制了测序机器的销售，测序仪生产商也应该联合起来解决这一难题。
同时，制造商应该致力于制定以研究领域为基础而不是以不同公司为基础的生物信息学解决方案。
因此，如果新一代测序平台真的能够带动基因组测序“普及化”——让基因组测序从大型测序中心走入每个研究人员的实验室或者小型研究小组，那么还需要研究人员付出更多努力，开发出经济实惠的分析软件以及数据管理系统。
目前的状况是，与新一代测序技术相关的生物信息学分析工作仅仅掌握在少数人手里，但是这一具有重要价值的技术毫无疑问应该由大多数人掌握。
如果数据处理问题不能得到有效解决，那么ABI公司的SOLiD系统、454公司的超高通量基因组测序系统——GSFLX、Illumina公司的GAII系统等新一代测序仪就永远无法真正出现在能够展现其价值的舞台上。
原文检索：
Editorial.（2008）Prepareforthedeluge.NatureBiotechnology,26（10）:
1099.
、传统的DNA测序技术Sanger测序法
自上世纪90年代初，所有的DNA测序操作几乎无一例外地全部采用半自动化毛细管电泳Sanger测序法（图1a）。
而后来出现的高通量测序方法则首先采用以下两种方法中的一种对DNA进行预处理（表1）。
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无论采用以上哪种方法处理后，我们均可以得到大量的待测序模板片段一一质粒或PCR产物。
随后，测序仪会进行循环测序”反应。
在每一轮测序反应的引物延伸步骤中，会随机引入已被四种不同颜色荧光分别标记的ddNTP（ddATP、
ddTTP、ddGTP、ddCTP）以终止延伸反应。
这样就形成了大量末端被荧光标记的、长短不一（终止位点不同）的延伸产物。
接着，再用高分辨率的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，计算机软件会自动读出”DNA序列。
不过，该方法在读取”每一个碱基信息时都有可能出错。
后续操作中，比如基因组组装或者找出变异位点等就是具体情况具体解决了。
一般，这种高通量测序仪一次最多只能同时进行96个或384个样品测序。
SangerDNA测序技术经过了30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达1,000bp的DNA片段进行测序了，而且对每一个碱基的读取准确率高达99.999%。
在高通量基因组鸟枪法测序操作当中，使用Sanger测序法的费用大约
为0.5美元/1,000个碱基。
JayShendure&
HanleeJi.（2008）Next-generationDNAsequencing.NatureBiotechnology,26（10）:
1135-1145.
、新一代DNA测序技术
DNA测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通量DNA测序技术予以解决。
过去三年，大规模平行测序平台（massively
parallelDNAsequencingplatform）已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的特权”能够被众多研究人员分享。
目前，新的测序技术及手段还在不断涌现，比如最新的进展就包括建立序列数据库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试验等等。
新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
今后，各种测序将成为一项广泛使用的常规实验手段，这有望给生物学和生物医学研究领域带来革命性的变革。
DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程。
迄今为止，我们获得的绝大部分DNA序列都是基于Sanger测序法获得的。
在过去5年间，人们至少从以下四个方面刺激了DNA测序技术的发展（表2）。
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1.具有代表性的新一代DNA测序仪
最近市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国RocheAppliedScienee公司的454基因组测序仪、美国lllumina公司和英国Solexatechnology公司合作开发的Illumina测序仪、美国AppliedBiosystems公司的SOLiD测序仪、Dover/Harvard公司的Polonator测序仪以及美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪。
所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略一一循环芯片测序法（cyclic-array
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，也可将其称为新一代测序技术或者第二代测序技术
所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应（模板变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。
2005年，有两篇论文曾对这种方法做出过详细介绍。
与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉的优势，于是很快就获得了广泛的应用。
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虽然这些新一代测序仪以及芯片的实际制作过程似乎都和传统的测序方法有很大的不同，而且各有特点（表3）,但实际上它们背后的原理和技术都是非常相似甚至是相同的（图1b）。
新一代测序法首先也是将基因组DNA随机切割成小片段DNA分子，然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库，也可以使用配对标签（mate-pairedtag制成跨步文库（jumpinglibraries）。
随后可
以通过原位polony（insitupolony,小词典1）、微乳液PCR（emulsionPCR）或桥式PCR（bridgePCR）（图5）等方法获得测序模板。
上述方法有一个共同点，那就是任何一个小片段DNA分子的PCR扩增产物都是在空间上聚集的：
原位polony法和桥式PCR法中所有的产物都集中在平板的某处，在微乳液PCR法（emulsionPCR）中所有的产物都集中在微珠的表面。
真正的测序反应本身和传统测序法一样，是由重复的聚合酶促反应和最后的荧光读取分析反应组成（图6）。
本文讨论的所有测序仪都是使用合成测序法（sequencingbysynthesis），即通过聚合酶或连接酶不断地延伸引物获得模板序列，最后对每一轮反应的结果进行荧光图像采集、分析，获得序列结果。
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注：
虽然目前测序片段长度短和准确率不高这两个缺点限制了新一代测序技术的应用，不过应该坚信，我们最终一定会克服这些问题。
就好像经过了30年的努
力，传统的测序技术也今非昔比，到达了今天的水平一样。
1.1454测序仪
454测序仪的出现极大促进了测序业务的开展，科研人员已经将测序技术作为解决科研工作中许多常见问题的利器。
这是因为454测序仪在以下几个方面取得了质的突破：
首先是解决了高通量测序问题；
其次它简化了样品准备步骤，将以往转化大肠杆菌扩增质粒的繁琐过程全部用简单的体外PCR扩增法替代了；
最
后，它缩小了测序反应体积，节省了试剂。
这样，454测序仪做到了以极其低廉
的价格进行大规模平行测序反应。
它的测序规模之大、测序费用之低是以往的测序仪无法匹敌的。
454测序仪与其它的新一代测序仪一起，降低了测序检测的费用，推动了测序技术平民化进程，使得小实验室也能开展测序检测项目，打破了以往只有少数几个大型测序中心才能进行测序研究的垄断地位”在过去的18
个月里，由于有了454测序仪的帮助，人们对人类基因组的结构有了更深入的了解，同时第一次使用非Sanger测序法对个人进行了测序，还建立了一种发现小RNA的新方法。
不过，要能让更多的人使用上新一代的测序产品，它们还需要变得更便宜，并且更加容易操作。
在一段时间之内，454测序仪必定会进一步降
低测序费用，帮助人们迎接个人基因组时代的到来。
自从诺贝尔奖得主FrederickSanger和WalterGilbert（图2）分别发明了链终止法DNA测序技术（sequencingbychainterminationtechnique）和链断裂法DNA测序技术（sequencingbychainfragmentationtechnique）之后，人们就一直希望能够扩大DNA测序技术的处理规模。
至打今天，我们对测序技术的需求和对计算机技术的需求一起出现了迅猛的增长，因为测序技术的发展速度已经远远跟不上实验要求的增长速度。
于是出现了好几种替代Sanger测序法的新型测序方法，比如杂交测序法、借助原子力显微镜（atomicforcemicroscopy）直接DNA成像测序法（directimagingofDNAsequenee）、质谱分析法、合成测序法以及微液流测序法等等。
在我们进行人类基因组计划时还出现了三项技术改进方法，即使用荧光标记物取代了放射性标记物来标记终止碱基（双脱氧碱基）；
使用毛细管
电泳（capillaryelectrophoresis）取代了传统的平板凝胶电泳；
建立了末端配对测序法（paired-endsequencing来对质粒、fosmid、人工细菌染色体（BAC）等短片段序列进行测序，解决了测序长度带来的限制问题。
同时，开展研究的自动化液体分装技术（liquid-handlingrobotics）帮助我们摆脱了人工试管操作，可以用自动化的方式在微量滴定板（microtiterplate）上装载待测序样品（质粒等），极大地降低了测序的费用和劳动强度。
随着美国454LifeSciences公司（该公司现已被美国罗氏公司收购）的第一台新一代测序仪一一454测序仪的面世，我们获得了一种完全不同的测序方式。
454测序仪引领的新一代测序技术在一直困扰传统测序技术的三个瓶颈问题上取得了突破。
这三个问题分别是文库制备、模板制备和测序。
而且，在随后出现的其它新一代测序仪产品身上，我们或多或少都会发现在454测序仪上使用到的技术，这也足以说明454测序仪的技术创新的确取得了巨大的成功。
454测序仪的先行者地位使它对整个测序业的影响远远超过了其它新一代测序仪竞争对手。
这一点从Leamon、Rothberg等人撰写的一篇介绍2005年技术进展的论文被引用了570多次的事实，以及有100多篇经过同行审议的关于人类遗传学、代谢组学、生态学、进化学以及古生物学的论文（peer-reviewedpublications）都是使用454测序仪开展的研究多个事实中都能够得到证明。
454测序仪技术是继Sanger测序技术之后出现的第一个用于对细菌基因组进行从头测序的新技术，也是第一个被用来对人类基因组进行测序的非Sanger测序技术。
其它使用454测序仪开展的重要研究项目包括探究蜜蜂消失原因的项目、研究人类基因组重排复杂性的项目、建立用于研究传染性疾病新方法的项目以及对尼安德特尔人（Neandertha）l基因组的测序项目等。
1.1.1摩尔定律对454测序仪的影响
454测序仪的迅猛发展不是因为我们想要Sanger测序仪小型化,而是因为新型奔
腾芯片的出现以及摩尔定律法则给我们带来的希望。
很明显，常规的人类基因测序项目会对我们处理测序技术的能力提出更高要求，这与我们对计算机处理能力的要求是一样的。
不过，只有将计算机的电子管换成晶体管，才为后来集成电路技术的发展提供了可能，这正是计算机产业发展的关键所在。
而希望对传统的毛细管电泳技术进行改良，提高它的速度和处理规模，正如只用电子管直接制作集成电路一样不可能。
因此，如果将各种测序技术比作一个个晶体管，将一系列测序步骤整合起来比作集成电路，那么也就可以用摩尔定律来预测DNA测序技术的发展速度了。
合成测序法概念虽然在提出的时候还不算成功，但它的出现为测序仪小型化奠定了基础。
基于合成测序法出现了两种策略：
一种是循环可切除终止测序法（cyclicreversibleterminationtechnology）,即依次逐个添加荧光标记的碱基，继而检测荧光信号，切除荧光基团，如此往复；
另一种策略是焦磷酸测序法（sequencedbydetectingpyrophosphatereleas）e。
454测序仪采用的正是焦磷酸测序法，因为它似乎比第一种方法的效率更高。
结果证明，454公司的选择是正确的。
454测序仪采用的是小型化焦磷酸测序反应，测序模板准备和焦磷酸测序反应步骤都是在固态芯片上完成的。
实际上，早在上世纪90年代中期，焦磷酸测序技术就已经被科研界用来进行基因分型工作了，但那时的焦磷酸测序技术还不能够满足标准的测序实验要求，因为它的测序长度太短，因此只能用于旨在发现SNP的基因分型研究当中。
当时进行基因分型操作时，是在微量滴定板（microtiterplate）上进行的，可以连续进行最多96次基因分型实验，平均每个样品花费20美分。
那时焦磷酸测序还不能用于从头测序工作，因为从头测序需要对每一个尤其是第一个碱基都能准确地区分清楚，而焦磷酸测序只能简单地对已知位点的碱基进行检测，而且从头测序要求的测序长度也是焦磷酸测序法无法达到的。
不过，由于焦磷酸测序的原理是通过检测碱基掺入时发出的光来进行测序的（图3），所以它并不需要类似于电泳之类的物理分离过程来对碱基进行区分。
这也就是说焦磷酸测序仪可以“缩小（减）”到只需要检测光线就够了，而不需要像传统的测序仪还需要电泳设备，而这正是限制传统电泳仪小型化的关键所在。
发光检测方法还能够进行多路平行操作，但是直到454测序仪出现之前，还没有人这样做过，以前都是依次进行检测的。
和晶体管早期的遭遇一样（当时人们也怀疑晶体管替代不了电子管），人们同时对高密度的，用于并行焦磷酸测序的反应也充满了疑问。
不过，当我们不再在溶液中进行测序反应，而是将测序模板、所有的试剂（酶）都固定在平板上制成芯片之后，就获得了小型化的，能进行多路并行处理的测序仪，这就与晶体管被小型化并整合成集成电路的过程一样。
此外，借助微量滴定板上一个个的小孔所达到的将不同测序反应进行分隔这一目的，也能通过在单个固相支持物上进行严密包裹（隔离）的反应来实现。
在这些各自隔绝的反应体系中，链聚合反应速度和
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